Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Si ringrazia Laura Denti, Valentina Senatore e il personale dell'unità risorse biologiche presso la UCL Institute of Ophthalmology per aiutare con allevamento del mouse e Camille Charoy per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Medical Research Council (MR/N011511/1) a C. Rührberg e un British Heart Foundation PhD studentship di J.T. Brash (FS/13/59/30649).

Tutto il lavoro animale è stato effettuato seguendo UK Home Office e le linee guida istituzionali Animal Welfare ed etici recensione corpo (AWERB).
1. preparazione Mouse
Nota: Eseguire esperimenti su topi adulti di almeno 8 settimane di età, fino a 6 mesi di età. Al fine di dimostrare la riproducibilità tecnica e tempistica coerenza per ogni passaggio di questa procedura tra animali diversi, utilizzare un minimo di 2 e massimo di 6 topi per ogni sessione sperimentale. Per valutare l'effetto di una mutazione su una sostanza che induce permeabilità in topi geneticamente modificati, idealmente, usare 2 topi mutanti e 2 littermate controlli per esperimenti.
<ol><li>24 h prima del hyperpermeability vascolare stimolante, anestetizzare topi usando un adatto inalazione anestetica come isoflurano. Utilizzare 3% isoflurane per induzione di anestesia, fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni. Utilizzare isoflurane 1.5% per la manutenzione di anestesia (assicurarsi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti). Nell'ambito dell'anestesia, radere accuratamente entrambi i fianchi di ogni mouse con un rasoio elettrico, evitando lesioni alla pelle. Nota: L'anestesia è usata per evitare di causare stress per l'animale e ridurre al minimo il movimento durante la rasatura, che può provocare danni alla pelle.</li>
	<li>Tornare il mouse rasato alla sua gabbia a casa. Per topi maschi, luogo ogni maschio in una gabbia individuale dopo il recupero di anestesia per evitare combattimenti e, di conseguenza, danneggiare la pelle. Per topi femmina, restituirli in un gruppo di loro gabbia a casa. Nota: Se viene osservato un comportamento combattimento tra topi maschi nella gabbia, prima della procedura, separarli in gabbie individuali per 3 giorni prima dell'esperimento per consentire potenziali danni alla pelle di guarire.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a recuperare la coscienza (di solito entro pochi secondi) e muoversi intorno alla gabbia (di solito entro 1 min).</li>
</ol>2. endovenosa di Evans Blue Dye
<ol><li>In un flusso laminare, preparare soluzioni sterili separate del maleate di pyrilamine inibitore dell'istamina (4 µ g / µ l di soluzione fisiologica allo 0,9%) e del colorante blu di Evans (1% p/v in soluzione fisiologica allo 0,9%). Sterilizzare le soluzioni di passaggio attraverso un filtro 22 µm.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per iniettare intraperitonealmente ogni mouse con 10 µ l pyrilamine maleato soluzione/grammo di peso corporeo (Figura 1A). Per eseguire la collottola prima, iniezione, il mouse e quindi inclinarlo in modo che la testa è diretto verso il suolo e l'addome è diretto verso l'alto. Iniettare nei quadranti inferiori dell'addome partire dal midline per evitare di colpire la vescica. Nota: Il peso dei topi tra 8 settimane e 6 mesi di età solitamente varia tra 15 e 30 g. Pyrilamine maleato inibisce il rilascio di istamina endogena, che altrimenti sarebbe promuovere perdita vascolare indipendentemente l'agente da testare.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una camera di calore di 37 ° C per 10 min promuovere la vasodilatazione. In alternativa, utilizzare una lampada di calore adatto focalizzata sulla coda per promuovere la vasodilatazione se è consentito l'uso di una lampada di calore dagli orientamenti etici locali.</li>
	<li>Spostare un mouse contemporaneamente a un dispositivo di ritenuta del mouse e strofinare la coda con etanolo al 70% per pulire l'area di iniezione e promuovere ulteriormente la vasodilatazione.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 1 mL con ago 30g per amministrare 100 µ l blu di Evans per via endovenosa attraverso la vena caudale (Figura 1B). Immediatamente applicare pressione al sito di iniezione tenendo la coda tra un dito e il pollice per prevenire le emorragie. Nota: Visualizzazione della vena della coda può essere migliorata da dirigere la luce alla zona di iniezione. Ulteriori dettagli sull'esecuzione di iniezioni endovenose nella vena della coda del mouse possono essere trovato in un protocollo pubblicato18.</li>
	<li>Consentire la tintura di circolare per 30 min.</li>
</ol>3. stimolare Hyperpermeability vascolare
<ol><li>Utilizzando soluzioni sterili in un flusso laminare, diluire l'agente d'induzione permeabilità di interesse ad una concentrazione che consente la dose finale deve essere consegnato in un volume di 20 µ l. Nota: L'esperimento di esempio illustrato nella Figura 1-Figura 2, che VEGFA è usato per stimolare hyperpermeability vascolare ad una concentrazione di 2,5 ng / µ l di PBS, producendo una dose totale di 50 ng e PBS viene utilizzato come un controllo del veicolo.</li>
	<li>Caricare l'agente d'induzione permeabilità di interesse e il controllo del veicolo in separato 2 sterile 300 µ l siringhe con ago 31G. Caricare la soluzione sufficiente per iniettare ogni mouse con 20 µ l della soluzione in triplice copia (cioè preparare 60 µ l di agente e veicolo per mouse, più volume aggiuntivo per tenere conto per volume morto dell'ago).</li>
	<li>Anestetizzare il primo mouse per essere testato con isoflurano (3% per induzione di anestesia fino a che il riflesso di raddrizzamento e il mouse non risponde agli stimoli esterni e 1,5% per la manutenzione di anestesia, assicurandosi che il mouse ha i ritmi respiratori costanti).</li>
	<li>Iniettare per via intradermica 20 µ l dell'agente promotore permeabilità nel fianco del mouse (Figura 1). Assicurarsi che l'ago sia ad un angolo di 15° per la pelle. Verifica per la formazione di una bolla rialzata all'interno della pelle che indica un'iniezione di successo. Ripetere l'iniezione intradermica a 2 siti aggiuntivi, un minimo di 1 cm.</li>
	<li>Ruotare il mouse per esporre il fianco 2 e ripetere triplicate iniezioni con la soluzione di controllo veicolo. Registrare sulla carta la posizione di ogni sito di iniezione per facilitarne l'identificazione per la successiva raccolta di campioni di pelle. Nota: Maneggiare la pelle del topo con cautela in questa fase; ad esempio, evitare di pizzicare la pelle durante l'esecuzione di iniezioni intradermiche.</li>
	<li>Tornare il mouse iniettato alla sua gabbia a casa e controllare il mouse fino a quando si recupera la coscienza (di solito entro pochi secondi) e si muove intorno alla gabbia.</li>
	<li>Mentre il primo mouse recupera, immediatamente ripetere i passaggi da 3.3 e 3.5 con il mouse secondo, e così via (fino a 6 topi al massimo per ogni sessione). Tenere traccia del tempo che ogni mouse è stato iniettato per regolare l'ora in cui procedere al passaggio successivo.</li>
</ol>4. quantificazione di blu di Evans accumulati all'interno del derma
<ol><li>Abbattere ogni mouse di dislocazione cervicale 20 min dopo che ha ricevuto le iniezioni intradermiche, osservando lo stesso ordine in cui i topi sono stati iniettati. Nota: La durata di perdita vascolare può variare a seconda dell'agente d'induzione permeabilità utilizzato, e, di conseguenza, il tempo tra l'iniezione intradermica e abbattimento potrebbe essere necessario ottimizzare.</li>
	<li>Luogo ogni abbattuti del mouse sulla sua schiena e perno i piedi su una tavola di sughero avvolto con un panno pulito (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzando le forbici smussate, praticare un'incisione verticale di circa 3-4 cm dalla parte inferiore dell'addome fino al petto di topo morto. Con un bisturi e pinze, stuzzicare via la pelle da entrambi i fianchi per rivelare il lato interno del derma e siti di accumulo di blu di Evans (Figura 1E). Appuntare giù la pelle flaccida e rimuovere il grasso dalle regioni intorno al sito di perdite con un bisturi. Se necessario, prendere una foto rappresentativa per dimostrare la grandezza di perdita di blu di Evans nella pelle.</li>
	<li>Usando un bisturi e pinze, accise regioni della pelle che comprende il colorante blu di Evans trapelato per ogni sito iniettato con l'agente d'induzione permeabilità o veicolo. Nota: fare attenzione a dimensioni simili regioni della pelle per assicurarsi che, alle successive 4.7 di passaggio, una parte simile del volume formammide sarà essere adsorbita da ogni campione di pelle, consentendo la tintura estratta da diluire in un volume simile di formammide rimanente per asportare . La mappa di iniezione registrata nel passaggio 3.5 vi aiuterà a definire l'area da essere asportata.</li>
	<li>Ogni campione viene posto in una provetta da 1,5 mL ed etichettato di conseguenza, assicurandosi che ogni campione poggia sul fondo del tubo. Conservare i campioni a - 20 ° C fino all'utilizzo ulteriore. Se l'elaborazione immediatamente, seguire la procedura riportata di seguito.</li>
	<li>Asciugare i campioni di pelle durante la notte mettendo tubi aperti in forno o nel pozzo di un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Per estrarre il colorante blu di Evans, aggiungere 250 µ l di formamide deionizzata ai campioni in una cappa, chiudere i tubi. Assicurarsi che i campioni di pelle sono tutti coperti da formammide e incubare per una notte in un forno o un blocco di riscaldamento a 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugare i campioni in una centrifuga da banco a massima velocità (> 10.000 x g) per 40 min.</li>
	<li>In una cappa, trasferire 100 µ l del supernatante contenente colorante da ciascun campione in un pozzo separato di una piastra a 96 pozzetti trasparente, piatto fondo (Figura 2A).</li>
	<li>Picco di misura assorbanza di blu di Evans a 620 nm con una lettura di riferimento di 740 nm in uno spettrofotometro. Nota: 620 nm è l'assorbanza del picco di blu di Evans, mentre 740 nm non è assorbito dal blu di Evans e funge da una lunghezza d'onda di riferimento.</li>
	<li>Media le letture di assorbanza delle iniezioni triplice copia dello stesso agente o veicolo per ogni mouse per rappresentare la variabilità tecnica (Figura 2B).</li>
	<li>Calcolare la differenza di piega delle letture da agente d'induzione permeabilità rispetto al controllo del veicolo (Figura 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. 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Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per dichiarare.

Dalla sua prima descrizione nel 195217, il dosaggio di Miles ha fornito i ricercatori con un metodo relativamente rapido, semplice e affidabile per lo studio dei meccanismi molecolari di hyperpermeability vascolare. Ad esempio, il dosaggio di Miles è stato utilizzato per testare la capacità e/o potenza di diversi agenti per indurre hyperpermeability19,20,21 o per testare l'efficacia di hyperpermeability blocco agenti8 ,22,23. Come altro esempio, gli agenti che inducono la permeabilità vascolare sono stati testati in topi geneticamente modificati ed i loro comandi littermate per determinare i requisiti di specifici recettori e proteine per hyperpermeability indotta da legante di trasduzione del segnale le risposte10,11,12,13,14,15,20,23. Diverse versioni modificate del dosaggio Miles da allora sono state usate, ad esempio per quanto riguarda il tracciante utilizzato. Così, blu di Evans è stato sostituito in alcuni studi con fluorescenza-labeled destrani di diverse dimensioni o microsfere11,13.
Il vantaggio principale del dosaggio Miles su altri saggi per studiare i meccanismi vascolari hyperpermeability è che è relativamente facile da eseguire e non richiede costose attrezzature. Inoltre, come tecnica di in vivo , questa perdita vascolare di modelli di analisi nel contesto dei vasi sanguigni intatti, al contrario di misurazione perdita attraverso in vitro dosaggi come trans bene le analisi di flusso o trans endoteliale resistenza elettrica ( Saggi TEER), che si concentrano, esclusivamente, sul monostrato endoteliale. I saggi alternativi in vivo di hyperpermeability vascolare possono differire del dosaggio di Miles qui descritto utilizzando un percorso di consegna diverso per l'agente d'induzione hyperpermeability o analizzando la perdita vascolare in siti diversi, per esempio di consegna sistemica di un agente tramite vena caudale seguita da esame di perdita vascolare nei polmoni o la trachea11,13,15. Una limitazione del dosaggio Miles è che l'iniezione intradermica di determinati agenti potrà, in linea di principio, anche influenzare la pressione sanguigna e il flusso oltre alla rottura della barriera endoteliale e, pertanto, anche indirettamente influisce sulla permeabilità vascolare. Tuttavia, questo test recentemente è stato indicato per misurare la permeabilità vascolare indotta da VEGF-A indipendentemente dagli effetti sulla pressione arteriosa sistemica15. Un'altra limitazione del dosaggio Miles è che letti vascolari in tessuti differenti possono rispondere diversamente a permeabilità-Promozione agenti e i risultati ottenuti con un dosaggio di Miles nella pelle possono, quindi, non essere rappresentante, ad esempio, di ciò che avviene nella polmone o il cervello.
Età e il peso dell'animale possono influenzare la perdita osservata nell'analisi della Miles. Per ridurre al minimo l'effetto di queste variabili, i ricercatori devono utilizzare littermates o similmente dimensioni e topi come controlli invecchiati. Quando si valutano i mutanti del topo per un particolare gene di interesse, topi devono essere generati attraverso un eterozigote contro littermates di strategia e wildtype eterozigoti allevamento utilizzati come controlli. Inoltre, si consiglia di utilizzare anestetici gas rapidamente reversibili, come isoflurano, per evitare di vasocostrizione, che è stato descritto per qualche farmaco anestetico somministrato tramite iniezioni parenterali24,25. L'iniezione di blu di Evans in vena caudale laterale del mouse è un passo fondamentale in questo protocollo e può notevolmente influenzare la qualità dei dati e esperimento. Così, i ricercatori devono essere competenti nell'esecuzione di iniezioni di vena di coda e sarà probabilmente bisogno di precedente esperienza o pratica prima di iniziare che le miglia saggio sperimentare. In alternativa, i ricercatori potrebbero utilizzare altre vie endovenosa per recapitare Evans blu, come l'iniezione di retro-orbitale se essi vengono vissuti con esso. Iniezione intradermica di permeabilità-promuovere soluzioni possono causare danni di agente indipendente per la pelle. Pertanto, iniezioni intradermiche non deve superare i 20 µ l di volume, dovrebbero sempre essere effettuate in presenza dell'inibitore dell'istamina e normalizzate a iniezioni di controllo del veicolo.
Il dosaggio di Miles è stato utilizzato da molti ricercatori per valutare componenti il VEGF-A della via di segnalazione, ad esempio, perché permeabilità vascolare indotta da VEGF-una causa di ascite nel cancro pazienti16 e visione-alterando l'edema in parecchi neovascolare occhio malattia7. Così, noi ed altri abbiamo usato l'analisi di Miles per confrontare il VEGF-A perdita vascolare indotta in topi geneticamente modificati per la mancanza di componenti specifici del VEGF-A segnalazione cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. il nostro studio recente utilizzando questo approccio ha rivelato che l'isoforma patologica principale di VEGF-A, VEGF165, segnali attraverso un complesso di VEGFR2 e NRP1, in cui il dominio citoplasmatico di NRP1 promuove l'attivazione di chinasi-mediata di ABL di chinasi della famiglia SRC per evocare una risposta di hyperpermeability14. VEGFA, inoltre, promuove la crescita dei vasi sanguigni e potrebbe, pertanto, essere utilizzato terapeuticamente per ripristinare il flusso sanguigno ai tessuti ischemici se sue attività hyperpermeability potrebbe essere specificamente inibita. Ricerca delucidare il meccanismo molecolare che dirige il VEGF-A risposte delle cellule endoteliali vascolari verso hyperpermeability vascolare potrebbe, pertanto, individuare percorsi che possono essere manipolate in modo selettivo per inibire patologico VEGF-A ha indotto l'edema nelle malattie, come il cancro o malattia ischemica dell'occhio. Il dosaggio di Miles senza dubbio continuerà a essere un metodo utile per sostenere questi e molti altri tipi di studi funzionali per delucidare molecolari regolatori ed effettori della hyperpermeability vascolare.

La funzione primaria del sistema cardiovascolare è quello di consentire il trasferimento di gas, nutrienti e prodotti di scarto tra la circolazione e tessuti in tutti gli organi. Vasi sanguigni hanno organo-specifici livelli di permeabilità basale per consentire tali scambi1. Per esempio, i vasi sanguigni nel rene sono altamente permeabili, mentre la barriera ematoencefalica costituisce un'interfaccia altamente impenetrabile, stretto2,3,4. Le cellule endoteliali che formano il rivestimento interno dei vasi sanguigni forniscono una barriera fisica tra la circolazione e tessuti sottostanti e regolano la permeabilità vascolare in un modo di organo-specific. Tuttavia, determinati stimoli causano un crollo parziale della barriera endoteliale per aumentare lo stravaso di fluido dalla circolazione nell'interstizio sopra i livelli basali di1. Tale hyperpermeability è osservata, per esempio, ai luoghi del trauma dei tessuti, nell'infiammazione, nei tumori, durante la sepsi, in occhi con malattia neovascular o nel cervello e nel cuore, quando ischemia del tessuto si verifica a causa di un ictus o un infarto miocardico, rispettivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevati, hyperpermeability conduce all'edema, che a sua volta provoca danni ai tessuti, come la perdita della visione nell'occhio malattia9. Così, la modellazione della risposta vascolare hyperpermeability è auspicabile per la comprensione dei meccanismi che aumentano la permeabilità endoteliale e per testare l'efficacia degli agenti progettati per inibire questo.
Il dosaggio di Miles è una tecnica ben consolidata, comunemente usata e relativamente semplice che misura perdita vascolare in vivo come una misura di surrogato del hyperpermeability vascolare. Anche se essa non tener conto ad aggravare i fattori che possono aumentare la perdita vascolare indipendentemente dal regolamento barriera endoteliale, quali pressione sanguigna o flusso sanguigno, il dosaggio di Miles è generalmente pensato per fornire un metodo affidabile per valutare la permeabilità-modulazione attività di sostanze e identificare i mediatori di segnalazione che promuovono la loro attività. Di conseguenza, il dosaggio di Miles è stato parte integrante di numerosi studi che hanno identificato mediatori di hyperpermeability vascolare e dei loro meccanismi di azione10,11,12,13, 14,15, ad esempio il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A che è stato originariamente identificato come il fattore di permeabilità vascolare VPF16.
Originariamente sviluppato da miglia e miglia per studiare la permeabilità vascolare in cavie17, loro dosaggio è stato successivamente adattato all'utilizzo di topi, che sono ora l'organismo modello di scelta per delucidare i meccanismi molecolari della permeabilità vascolare regolamento a causa della loro idoneità squisita di manipolazione genetica. Brevemente, colorante blu di Evans è per via endovenosa iniettato in topi adulti e ammessi a circolare per 30 minuti (Figura 1). Agenti d'induzione permeabilità contro controllo veicolo quindi vengono iniettati per via intradermica in più siti su opposti fianchi del mouse per indurre la perdita vascolare (Figura 1). Di conseguenza, colorante blu di Evans albumina extravasates e si accumula nel derma (Figura 1). Dopo umanamente abbattimento il mouse, blu di Evans è estratta dal derma e il livello di perdita vascolare calcolato come il rapporto del test al veicolo-indotte da sostanze di densità ottica (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Pyrilamine maleate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionised Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

La funzione primaria dell'endotelio vascolare negli organismi vertebrati è di servire come una barriera tra il sangue e ogni tessuto del corpo, per cui la permeabilità dell'endotelio a cellule del sangue, macromolecole del plasma e l'acqua può essere adattata secondo il bisogno fisiologico. In alcune malattie, citochine e fattori di crescita vengono rilasciati che mirano la barriera endoteliale per aumentare transitoriamente la permeabilità vascolare; Tuttavia, la loro presenza prolungata può causare hyperpermeability vascolare cronica e quindi danneggiano il tessuto dell'edema. Il dosaggio di Miles è una tecnica di in vivo che permette ai ricercatori di studiare hyperpermeability vascolare attraverso la misurazione di proxy di perdita vascolare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura nel topo, che è l'organismo di modello più ampiamente usato per studiare la patologia e fisiologia dei mammiferi. La procedura prevede l'iniezione endovenosa di blu di Evans per etichettare l'albumina circolante seguita da multiple iniezioni intradermiche di agenti d'induzione permeabilità e soluzioni di controllo del veicolo in opposti fianchi del mouse. Di conseguenza, colorante blu di Evans perde gradualmente nel derma, dove si accumula e può essere estratta per quantificazione come perdita indotta dall'agente d'induzione permeabilità rispetto al veicolo. Il dosaggio di Miles può essere eseguito in wild-type o geneticamente modificati modelli murini e può essere combinato con drug administration per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare e identificano gli agenti/bersagli in grado di indurre o il blocco hyperpermeability.

Abbiamo usato l'analisi di Miles per valutare la capacità del VEGF-A di indurre perdita vascolare rispetto al controllo del veicolo (PBS) in topi C57/Bl6 wildtype. Qui, indichiamo un rappresentanza esperimento utilizzando topi selvatici stimolati con l'iniezione intradermica di 20 µ l di soluzione contenente 50 ng di VEGF-A in PBS o veicolo PBS solo. Un chiaro aumento nella perdita di colorante blu di Evans in campioni di pelle iniettato con VEGF-A rispetto a PBS era apparente in situ (Figura 1E) e dopo l'estrazione del colorante in formammide (Figura 2A). Quantificazione degli esperimenti multipli illustra che 50 ng di VEGF-A induce significativamente più Evans blu perdita di PBS da solo (Figura 2B), con una media 3 volte aumentare in perdita vascolare rispetto al veicolo (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figura 1: induzione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Rappresentazione schematica (pannello superiore) e immagini corrispondenti (pannello inferiore) dei passaggi sequenziali durante l'esecuzione del test di Miles nel topo. (A) Pyrilamine maleato è iniettato intraperitonealmente per impedire il rilascio di istamina endogena 10-30 minuti prima dell'iniezione endovenosa (B) di 100 µ l 1% Evans blue nella coda della vena del mouse. (C), 30 min più tardi, vascolare perdita è indotta tramite l'iniezione intradermica dell'agente (50 ng di VEGF-A; verde cerchi) contro controllo veicolo (PBS; cerchi bianchi). (D, E) Per accedere ai siti di accumulo di blu di Evans, il mouse è abbattuti 20 minuti dopo le iniezioni intradermiche e la pelle di entrambi i fianchi dissecato e appuntato giù. i.p.: intraperitoneale; i.v.: endovenosa; i.d.: intradermica; scala bar, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figura 2: quantificazione di perdita vascolare nell'analisi della Miles. Evans (A) colorante blu viene estratta in formammide da campioni di pelle ottenuti da ogni iniezione intradermica nella Figura 1 e caricato in una piastra a 96 pozzetti per lettura con uno spettrofotometro dell'assorbanza. (B, C) Rappresentazione grafica delle letture di assorbanza da esperimenti multipli tracciando entrambi valori (B) l'assorbanza normalizzato (densità ottica, OD) di entrambi l'agente d'induzione permeabilità (VEGF-A; scuro verde cerchi) e veicolo (PBS; grigio Cerchi), o (C) modifica la piega in OD per l'agente rispetto al veicolo (barre di errore: SEM). Le letture di assorbanza della triplice copia PBS e campioni di VEGF-A mostrato in (A) sono una media e mostrate in (B, C) come cerchi bianchi o verde, rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K Views.  University College London. Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicina

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Bioingegneria

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Misurare Anafilassi locali nei topi

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Immunologia e infezioni

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Un approccio metodologico alle valutazioni non invasive di funzione vascolare e morfologia

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

Implementazione di precisione dei test di dose minima di erithema (MED) per valutare la variazione individuale nella risposta infiammatoria umana

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Biologia

Indagine su nuovi meccanismi di disfunzione microvascolare nell'uomo

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

Autore in primo piano: Un approccio di farmacodissezione per scoprire i meccanismi nelle popolazioni a rischio di malattie cardiovascolari 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

Microdialisi intradermica: un approccio per studiare nuovi meccanismi di disfunzione microvascolare nell'uomo

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

Valutazione vascolari agenti d'induzione Hyperpermeability nella pelle con il dosaggio di Miles

Riepilogo

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Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

Un

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali

Misurare Anafilassi locali nei topi

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Un approccio metodologico alle valutazioni non invasive di funzione vascolare e morfologia

Implementazione di precisione dei test di dose minima di erithema (MED) per valutare la variazione individuale nella risposta infiammatoria umana

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Microdialisi intradermica: un approccio per studiare nuovi meccanismi di disfunzione microvascolare nell'uomo

Microdialisi intradermica: un approccio per studiare nuovi meccanismi di disfunzione microvascolare nell'uomo