우리는 라 Denti 감사, 발 렌 세와 직원에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 기술 지원에 대 한 마우스 축산와 카밀 Charoy 도움이. 이 작품은 의료 연구 위원회 그랜트 (미스터/N011511/1) C. Ruhrberg와 jt는 가슴 앓이 (FS/13/59/30649)에 영국 심장 재단 박사 재학에 지원 됩니다.

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 기관 동물 복지와 윤리적 검토 바디 (AWERB) 지침에 따라 수행 되었다.
1. 마우스 준비
참고: 6 개월 최대 최소 8 주 나이의 성인 쥐에 실험을 수행 합니다. 기술 재현성 및 다른 동물 사이이 절차의 각 단계에 대 한 일관 된 타이밍을 설명 하기 위하여 각 실험 세션 6 쥐의 2의 최소값 및 최대값을 사용 합니다. 유전자 변형된 마우스에 침투성 유도 물질에 돌연변이의 효과 평가 하려면 이상적으로, 2 돌연변이 생쥐 및 실험 당 2 littermate 제어를 사용 합니다.
<ol><li>자극 혈관 hyperpermeability, 전에 24 h anesthetize 적합 한 흡입 isoflurane 등 마 취를 사용 하 여 마우스. 마 취 유도 3 %isoflurane 사용 하 여 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지. 1.5 %isoflurane 마 취 유지 보수에 대 한 사용 (마우스 지속적인 호흡 속도 보장). 마 취, 신중 하 게 두 측면 각 마우스의 피부에 상해를 피하는 전기 면도기, 쉐이브. 참고: 마 취 동물에 스트레스를 초래 하지 않도록 하 고 면도, 피부 손상 될 수 있습니다 동안 움직임을 최소화 하기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>그것의 집 감 금 소를 면도 마우스를 반환 합니다. 남성 쥐에 대 한 각 남자에 배치는 개별 케이지 방지 하기 위해 마 취 회복 후 싸움 하 고, 따라서, 피부 손상. 여성 쥐에 대 한 반환 그들 그룹에 그들의 집에 감 금 소에. 참고: 싸우는 행동 장에, 남성 쥐 사이에서 관찰 되는 경우 절차를 하기 전에 그들을 분리 개별 연습장으로 피부 손상이 치유 수 있도록 실험 하기 전에 3 일 동안.</li>
	<li>그들은 (일반적으로 몇 초 이내)의 식을 복구할 때까지 이동 (1 분) 이내 케이지 쥐를 모니터링 합니다.</li>
</ol>2. 에반스의 주사 파랑 염료
<ol><li>층 류 캐비닛, 히 스타 민 억제제 pyrilamine maleate (4 µ g / µ L 0.9% 식 염 수에) 그리고 에반스 블루 염료 (0.9% 식 염 수에 1 %w / v)의 별도 살 균 솔루션을 준비 합니다. 22 µ m 필터를 통해 솔루션을 전달 하 여 소독.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 intraperitoneally 10 µ L pyrilamine maleate 솔루션/그램의 몸 무게 (그림 1A)와 각 마우스를 주입. 수행 하 주입, 첫 번째, 아저씨는 마우스 고 머리는 땅으로 감독 하 고 복 부 위쪽으로 지시 된다 다음 그것을 기울이기. 방광을 타격을 피하기 위해 중간에서 복 부의 더 낮은 사분면에 주사. 참고: 8 주 및 6 개월의 나이 사이 마우스의 무게 보통 15와 30 g. Pyrilamine maleate 사이의 범위 것입니다 억제 혈관 누설 테스트 에이전트에 독립적으로 추진 그렇지 않으면 것 내 인 성 히 스타 민 방출.</li>
	<li>혈관 확장을 촉진 10 분 동안 37 ° C 열 챔버에 마우스를 놓습니다. 또는 열 램프의 사용은 로컬 윤리 지침에서 허용 하는 경우 혈관 확장을 촉진 하는 꼬리에 초점을 맞춘 적당 한 열 램프를 사용 합니다.</li>
	<li>마우스 restrainer를 한 번에 한 마우스를 이동 하 고 70% 에탄올 주입 영역을 청소 하 고 혈관을 더욱 촉진에 꼬리를 문 지 르 세요.</li>
	<li>30g 바늘으로 살 균 1 mL 주사기를 사용 하 여 100 µ L를 관리할 에반스 블루 염료 (그림 1B) 꼬리 정 맥을 통해 정 맥. 출혈을 방지 하기 위해 엄지 손가락 사이 꼬리를 눌러 압력 사출 사이트에 즉시 적용 됩니다. 참고: 시각화의 꼬리 정 맥 주입 영역에 등불을 연출 하 여 개선할 수 있습니다. 마우스 꼬리 정 맥에 정 맥 주사를 수행에 더 세부 사항 게시 프로토콜18에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>30 분 순환 하는 염료를 허용 합니다.</li>
</ol>3. 자극 관 Hyperpermeability
<ol><li>층 류 캐비닛에 살 균 솔루션을 사용 하 여, 마지막 복용량 20 µ L의 볼륨에 전달 될 수 있는 농도에 대 한 관심의 침투성 유도 에이전트 희석. 참고: VEGFA에 PBS, µ 2.5 ng/L의 농도에서 혈관 hyperpermeability를 자극 하는 그림 1-그림 2에 표시 된 예제에서는 실험에서 저조한 50 ng, 그리고 PBS의 총 복용량 사용 됩니다 차량 제어로.</li>
	<li>31 G 바늘으로 2 별도 살 균 300 µ L 주사기를 관심 및 차량 제어의 침투성 유도 에이전트를 로드 합니다. 로드를 3 중에서 솔루션의 20 µ L 각 마우스 주입 충분 한 솔루션 (즉, 바늘의 죽은 볼륨에 대 한 계정에 에이전트와 마우스, 플러스 추가 볼륨 당 차량 60 µ L 준비).</li>
	<li>Isoflurane (마 취 유도 righting 반사 손실 되 고 마우스 외부 자극에 응답 하지 않는 때까지 3%와 1.5% 마우스 지속적인 호흡 속도 확인 하 고 마 취 유지 보수에 대 한) 테스트를 첫 번째 마우스 anesthetize</li>
	<li>Intradermally 마우스 (그림 1C)의 측면에 침투성 홍보 에이전트의 20 µ L를 삽입할. 바늘을 피부에 15 °의 각도에서 인지 확인 합니다. 성공적인 주입을 나타내는 피부 내 제기 거품의 형성에 대 한 확인 하십시오. 2 추가 사이트는 최소 1 c m 간격에 피부 주입을 반복 합니다.</li>
	<li>2 측면을 노출 하 고 반복 제어 차량 솔루션 triplicate 주사 마우스를 설정 합니다. 피부 샘플의 후속 컬렉션에 대 한 그들의 id를 촉진 하기 위하여 각 사출 사이트의 위치 종이에 기록 합니다. 참고:이 단계; 주의 마우스 피부 처리 예를 들어 피부 피부 주사를 수행할 때 곤란 하 게 하지 마십시오.</li>
	<li>주입 된 마우스의 홈 케이지를 반환 하 고 의식 (일반적으로 몇 초 이내) 복구 하 고 감 금 소의 주위에 이동 될 때까지 마우스를 모니터링.</li>
	<li>최초의 마우스, 복구 하는 동안 즉시 단계 3.3 두 번째 마우스와 함께 3.5에 (최대 세션 당 극대로 6 쥐)를 반복 합니다. 다음 단계를 진행 하는 시간을 조정 하려면 각 마우스 주입 했다 시간의 기록을 유지.</li>
</ol>4. 진 피 내에서 축적 된 에반스 블루의 정량화
<ol><li>쥐 주입 했다 순서 관찰 피부 주사 받은 후 자 궁 경부 전위 20 분 여 각 마우스를 컬링 합니다. 참고: 혈관 누설의 기간 사용 하 고, 침투성 유도 에이전트에 따라 다를 수 있습니다 그리고, 그러므로, 피부 주입 및 학살 사이의 시간 최적화 할 수 있습니다.</li>
	<li>각 장소는 그것의 뒤에 코르크 보드에 그것의 발 (그림 1D) 깨끗 한 휴지로 싸서 핀 마우스를 잡아가고.</li>
	<li>무딘가 위를 사용 하 여, 죽은 마우스의 가슴까지 아랫에서 약 3-4 cm의 수직 절 개를 확인 합니다. 포 셉, 메스 피부 안쪽의 진 피와 에반스 블루 축적 (그림 1E)의 사이트에 두 측면에서 멀리 애타게. 그리고 느슨한 피부 아래 핀 메스와 누설 사이트 주위 지역에서 지방을 제거. 필요한 경우 피부에 에반스 블루 누설의 크기를 설명 하는 대표적인 사진을 찍어.</li>
	<li>포 셉, 메스를 사용 하 여 구성 된 각 사이트에 대 한 유출된 에반스 블루 염료 소비 세 피부 지역 침투성 유도 에이전트 또는 차량 주입. 참고: 비슷한 크기, 후속 단계 4.7에 formamide 볼륨의 유사한 부분 이다 흡착 될 나머지 formamide의 비슷한 볼륨에 희석 추출 된 염료를 수 있도록 각 피부 샘플 되도록 피부 영역을 삭제할 주의 . 3.5 단계에서 기록 된 주입 지도 excised 될 영역을 정의 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 각 샘플을 배치 하 고 튜브의 하단에 달려있다 각 샘플 확인 하 고 그에 따라 분류. 추가 사용까지 20 ° C에서-샘플을 저장 합니다. 즉시 처리 하는 경우 아래 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>오븐에서 또는 55 ° c.에가 열 블록의 우물에 오픈 튜브를 배치 하 여 피부 샘플을 밤새 껏 말리</li>
	<li>에반스 파란색 염료를 추출 하는 증기 두건에서 샘플을 이온된 formamide의 250 µ L를 추가, 튜브. 피부 샘플 들은 모두는 formamide 고 오븐 또는 55 ° c.에가 열 블록에서 밤새 품 어 다는 것을 확인합니다</li>
	<li>샘플 최대 속도로 벤치탑 원심 분리기에 원심 (> 10000 x g) 40 분.</li>
	<li>증기 두건에서 투명 하 고, 평평한 바닥 96 잘 접시 (그림 2A)의 별도 우물에 염료를 포함 하는 상쾌한의 100 µ L 각 샘플에서 전송.</li>
	<li>측정 최대 620에서 흡 광도 에반스 블루 nm 740의 참조 독서는 분 광 광도 계에 nm. 참고: 620 nm는 피크의 에반스 블루 흡 광도, 동안 740 nm 에반스 블루 흡수 되지 및 참조 파장 역할.</li>
	<li>기술 변화 (그림 2B)에 대 한 계정에 동일한 에이전트 또는 각 마우스에 대 한 차량 triplicate 주사의 흡 광도 신호 평균.</li>
	<li>차량 제어 (그림 2C) 대 침투성 유도 에이전트에서 판독의 배 차이 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 선언에 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

195217에 그것의 첫 번째 설명, 이후 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 분자 메커니즘을 공부에 대 한 비교적 간단, 신속 하 고 안정적인 방법으로 연구자를 제공 하고있다. 예를 들어 마일 분석 결과 능력 또는 다른 대리인의 힘 hyperpermeability19,20,21 을 유도 하거나 hyperpermeability 차단 에이전트8 의 효능을 테스트 하려면 테스트를 사용 되었습니다. ,2223. 또 다른 예로 혈관 침투성을 유발 하는 에이전트 테스트 유전자 변형된 생쥐와 그들의 littermate 컨트롤의 특정 수용 체와 신호 ligand 유도 된 hyperpermeability에 대 한 단백질 시험 요구 사항을 결정 하 응답10,11,12,13,,1415,20,23. 마일 분석 결과의 여러 수정된 버전 이후 사용 되고있다, 예를 들어 추적 프로그램 사용에 관하여. 따라서, 에반스 블루는 되었습니다 대체 다른 크기 또는 스피어11,13dextrans 형광 표시와 일부 연구.
조사 관 hyperpermeability 메커니즘에 대 한 다른 분석을 통해 마일 분석 결과의 주요 이점은 이다 그것은 비교적 쉽게 수행 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 또한, 기술로 vivo에서 , 그대로 혈관의 맥락에서이 분석 결과 모델 혈관 누설 통해 누설 측정으로 체 외에 분석 실험 같은 뿐만 아니라 트랜스 유량 분석 실험 또는 트랜스 내 피 전기 저항 ( 내 피 단층에, 전적으로, 초점 TEER) 분석 분석 실험 대체 vivo에서 혈관 hyperpermeability의 hyperpermeability 유도 에이전트에 대 한 다른 배달 경로 사용 하 여 또는 다른 사이트에서 혈관 누설에 대 한 분석 하 여 여기에 설명 된 마일 분석 결과에서 다를 수 있습니다. 폐 나 기관지11,,1315혈관 누설 시험 뒤 꼬리 정 맥을 통해 에이전트의 체계적 전달에 의해 예. 마일 분석 결과의 한 가지 한계는 특정 에이전트의 피부 주입 수 있습니다, 원칙적으로, 또한 혈압과 내 피 장벽 파괴 뿐만 아니라 흐름에 영향을, 따라서, 영향 하지 혈관 침투성도 직접. 그럼에도 불구 하 고,이 분석 결과 최근 표시 되었습니다 측정 혈관 침투성에 의해 유도 된 VEGF-A15조직 혈압 영향을 독립적으로. 마일 분석 결과의 또 다른 한계는 다른 조직에서 혈관 침대 응답 수 있습니다 다르게에 침투성 홍보 요원, 그리고 피부에 마일 분석 결과 함께 결과 않을 수 있습니다, 따라서, 대표, 예를 들어에서 발생의 이다는 폐 또는 두뇌입니다.
동물의 나 이와 체중 누설 마일 분석 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 변수들의 효과 최소화 하기 위해 연구원 littermates를 사용 해야 합니다 또는 마찬가지로 크기 고 컨트롤로 마우스를 세. 관심사의 특정 유전자에 대 한 마우스 돌연변이 평가할 때는 heterozygous heterozygous 번 식 전략 및 wildtype littermates 컨트롤로 사용 대 통해 쥐를 생성 합니다. 또한, 그것은 비 경구 주입24,25통해 관리 일부 마 취 약물에 대 한 설명 하고있다 vasoconstriction을 피하기 위해 isoflurane, 등 신속 하 게 되돌릴 수 가스 마 취약을 사용 하는 것이 좋습니다. 마우스 측면 꼬리 정 맥으로 에반스 블루 염료의 주입이이 프로토콜에서 중요 한 단계 이며, 실험 및 데이터의 품질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구원은 꼬리 정 맥 주사를 수행할 유능한 이어야 하며 것입니다 가능성이 필요 마일 시험 시작 하기 전에 이전 경험 또는 실험. 또는, 연구원은 에반스 블루, 복고풍 궤도 주입 그들은 그것을 경험 하는 경우 등을 제공 하 다른 정 맥 경로 사용할 수 있습니다. 침투성 추진의 피부 주입 솔루션 에이전트 독립 손상 피부에 발생할 수 있습니다. 따라서, 피부 주사 볼륨에서 20 µ l를 초과 하지 않아야 합니다, 해야 항상 히 스타 민 억제제의 실시 되며 차량 제어 주사 정규화.
마일 분석 결과 사용 되었습니다 많은 연구자에 의해 VEGF A 신호 통로의 예를 들어 구성 요소를 평가 하 VEGF A 유도 혈관 침투성 복수 암 환자16 및 여러 신생의 비전 방해 부 종 때문에 눈 질병7. 따라서, 우리와 다른 사용 마일 분석 결과는 VEGF A 신호 폭포12,13,14, 의 특정 구성 요소 부족 유전자 조작 된 생쥐에서 VEGF A 유도 혈관 누설을 비교 하 15 , 20 , 23.이 방법을 사용 하 여 우리의 최근 연구 결과 밝혀 주요 병 적인 VEGF A isoform, VEGF165, VEGFR2 및 NRP1, NRP1 세포질 도메인 SRC 가족 kinases의 ABL 중재 하는 키 니 아 제 활성화를 촉진 하는의 복잡 한을 통해 신호 14hyperpermeability 응답 보여주고 있습니다. 또한 VEGFA 혈관 성장을 촉진 하 고 따라서 치료 hyperpermeability 활동 특히 저해 될 수 있는 경우 허 혈 성 조직에 혈액 흐름을 복원 하는 데 사용할 수. Elucidating 혈관 hyperpermeability로 혈관 내 피 세포의 VEGF A 응답을 조 타 하는 분자 메커니즘 연구 따라서 병 적인 VEGF A 유도 부 종 억제 하기 위해 선택적으로 조작 될 수 있습니다 경로 식별할 수 있습니다, 에 질병, 암 등 허 혈 성 안과 질환. 마일 분석 결과 의심할 여 지 없이 이들과 많은 다른 유형의 기능 연구 분자 레 귤 레이 터 및 혈관 hyperpermeability의 이펙터를 명료 하 게를 근간에 유용한 방법으로 계속 됩니다.

심장 혈관 시스템의 주요 기능은 순환 및 모든 장기에서 조직 사이의 가스, 영양소, 및 폐기물의 전송을 활성화 하는 것입니다. 혈관 같은 교류1허용 기저 침투성의 기관 특정 수준이 있다. 예를 들어, 신장에 혈관은 혈액 뇌 장벽, 높은 꿰 뚫을 수 없는 인터페이스2,,34를 형성 하는 동안 높은 투과성, 있습니다. 혈관의 내벽을 형성 하는 내 피 세포 순환 및 기본 조직 사이 물리적 방 벽을 제공 하 고 기관 특정 방식으로 혈관 침투성을 조절. 그러나, 특정 자극 기저 레벨1위에 interstitium에 순환에서 액체 넘쳐 흐름을 증가 하는 내 피 방 벽의 부분적인 붕괴를 일으킬. 그런 hyperpermeability는, 예를 들어 조직 외상, 염증, 종양에 사이트에서 동안 관찰 패 혈 증, 신생 질병 또는 뇌와 심장, 눈에 조직 허 혈 뇌졸중 또는 심근 경색, 각각 발생 하는 경우 5 , 6 , 7 , 8. 만성 상승 하는 때 hyperpermeability를 차례로 눈 질환9시력의 손실 등 조직 손상, 부 종, 리드. 따라서, 혈관 hyperpermeability 응답 모델링은 내 피 침투성을 증가 하는 메커니즘을 이해 하 고 이것을 억제 하도록 설계 된 에이전트의 효능을 테스트 하는 것이 좋습니다.
마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 대리 측정으로 혈관 누설에 vivo에서 측정 하는 잘 설립 하 고, 일반적으로 사용 되 고 비교적 간단한 기술입니다. 합성 내 피 장벽 규제, 혈압 이나 혈액의 흐름, 별도로 혈관 누설을 증가 시킬 수 있습니다 요소 계정 고려 하지 않습니다 비록 마일 분석 결과 일반적으로 평가 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공 생각은 물질의 침투성 변조 활동 그들의 활동을 홍보 하는 신호 중재자를 식별. 따라서, 마일 분석 결과 혈관 hyperpermeability의 중재자와 행동10,,1112,13, 의 그들의 메커니즘을 식별 하는 다 수의 연구에 필수적인 되었습니다 14,15, 등 혈관 내 피 성장 인자 VEGF A는 VPF16혈관 침투성 요소로 식별 원래 이었다.
원래 마일이 고 기니 피그17혈관 침투성을 공부 하 여 개발 된, 그들의 분석 결과 혈관 침투성의 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 선택의 모델 유기 체 이제는 마우스를 사용 하 여 이후에 적응 했다 유전자 조작의 절묘 한 적합성으로 인해 규정. 간단히, 에반스 블루 염료는 정 맥 성인 쥐에 주입 하 고 30 분 (그림 1)에 대 한 순환 허용. 차량 제어 대 침투성 유도 요원은 intradermally 유도 혈관 누출 (그림 1) 마우스의 측면에 반대에 여러 사이트에 주입 됩니다. 따라서, 알 부 민-바운드 에반스 블루 염료 extravasates 하 고 (그림 1) 진 피에 축적. 마우스를 학살 하는 고통 없이, 후 에반스 블루 진 피에서 추출 되 고 혈관 누출의 레벨 테스트 물질을 차량-유도의 비율로 계산 광학 밀도 (그림 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

등뼈 동물 유기 체에 있는 혈관 피의 주요 기능은 혈액 세포, 플라즈마 고분자와 물에는 피 내 막의 침투성에 따라 적용할 수 있습니다 그것에 의하여 신체의 각 조직과 혈액 사이 방 벽으로 봉사 하는 생리 적인 필요 합니다. 특정 질병에서 cytokines 및 성장 요인 출시 대상으로 뚜렷이 증가 혈관 침투성; 내 피 장벽 그러나, 그들의 장기간된 존재 만성 혈관 hyperpermeability 그리고 그로 인하여 조직 손상 부 종이 발생할 수 있습니다. 마일 분석 결과 혈관 누설의 프록시 측정을 통해 혈관 hyperpermeability를 공부 하는 연구자를 허용 하는 비보에 기법 이다. 여기, 우리는 포유류 생리학과 병리학 공부에 가장 널리 사용 되는 모델 생물 마우스에서이 절차를 수행 하는 방법에 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 절차는 반대 하는 마우스의 옆구리에 침투성 유도 요원 및 차량 제어 솔루션의 여러 피부 주사 뒤 순환 알 부 민을 에반스 블루 염료의 정 맥 주입을 포함 한다. 따라서, 에반스 블루 염료는 점차 진 피로, 그것은 축적 하 고 차량 기준으로 유도 하는 침투성 에이전트에 의해 유도 된 누설으로 정량화에 대 한 추출 될 수 있다 누출. 마일 분석 결과 야생 타입에서 수행할 수 또는 유전자 마우스 모델을 수정 및 약국 혈관 침투성 규제 요원 대상 유도 또는 차단 수 있는 식별 하는 분자 메커니즘 연구와 결합 될 수 있습니다. hyperpermeability입니다.

우리 사용 마일 분석 결과 wildtype C57/Bl6 마우스에서 차량 제어 (PBS)를 기준으로 혈관 누설 유도 VEGF A의 능력을 평가 합니다. 자, 우리 대표 실험 50를 포함 하는 20 µ L 솔루션의 피부 주입으로 자극된 wildtype 마우스를 사용 하 여 보여 VEGF-A PBS 또는 차량 PBS만의 ng. VEGF A 주사 피부 샘플에서 에반스 블루 염료 누설에 명확한 증가 명백한 제자리에 (그림 1E)는 PBS에 비해 formamide (그림 2A)에 염료의 추출 후. 여러 실험의 정량화를 보여줍니다 50 ng VEGF의 크게 더 에반스 PBS 혼자 (그림 2B), 평균 보다 블루 누설 3-fold 혈관 누설 차량 (그림 2C)에 비해 증가 유도.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 그림 1: 마일 분석 결과에서 혈관 누설 유도. 도식 표현 (상단 패널) 및 해당 이미지 (하단 패널)의 순차적 단계는 마우스에서 마일 시험을 수행할 때. (A) Pyrilamine maleate intraperitoneally (B) 100 µ l 1% 에반스 블루를 꼬리에는 마우스의 정 맥의 정 맥 주입 전에 10 ~ 30 분 내 인 성 히 스타 민의 릴리스를 방지 하기 위해 주입. (C) 30 분 후, 혈관 누설 에이전트의 피부 주입에 의해 유도 된다 (50 ng VEGF-A;의 동그라미를 그린) 차량 제어 (PBS, 흰 동그라미) 대. (D, E) 에반스 블루 축적의 사이트에 액세스 하려면 마우스 피부 주사 후 학살된 20 분 이며 두 측면의 피부를 해 부하 고 쌓. i.p.: 복; i.v.: 정 맥; 아이디: 피부; 스케일 바, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 그림 2: 혈관 누설 마일 분석 결과에서 정량화. (A) 에반스 블루 염료 흡 광도 분 광 광도 계 독서에 대 한 96 잘 접시에 로드 및 그림 1 에서 각 피부 주입에서 가져온 피부 샘플에서 formamide에서 추출 됩니다. (B, C) 두 유도 하는 침투성 에이전트의 중 (B) 정규화 된 흡 광도 값 (광 밀도, OD) 그려서 여러 실험에서 흡 광도 판독의 그래픽 표현 (VEGF A; 어두운 동그라미를 그린) 및 차량 (PBS; 회색 서클), 또는 (C) 배 세에 차량 대 에이전트에 대 한 변경 (오차 막대: sem의). Triplicate PBS와 (A)에 표시 된 VEGF A 샘플의 흡 광도 수치는 평균 하 고 흰색 또는 녹색 원으로 각각 (B, C)에 표시 된. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  University College London. 여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

Neuroactive 대리점 지속 배달 Microinfusion 시스템의 구축 및 주입.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

연구

생물학

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood supply. The capillary lamina of the choroid lines the outer surface of the retina and is the dominating source of oxygen in most vertebrate retinas. However, this vascular bed is challenging to image with traditional optical techniques due to its position behind the highly light-absorbing retina. Here we describe a high-frequency ultrasound technique with subsequent flow-enhancement to image deep vascular beds (0.5-3 cm) of the eye with a high spatiotemporal resolution. This non-invasive method works well in species with nucleated red blood cells (non-mammalian and fetal animal models). It allows for the generation of non-invasive three-dimensional angiographies without the use of contrast agents, and it is independent of blood flow angles with a higher sensitivity than Doppler-based ultrasound imaging techniques.

We present a non-invasive ultrasound technique for generating three-dimensional angiographies in the eye without the use of contrast agents.

흐름이 향상된 초음파로 눈의 깊은 혈관 이미징

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

설치류의 머리에서 정의된 가속도를 생성하기 위한 수동 머리 움직임의 적용

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...