この作品は Transregio 174 "時空間ダイナミクスの細菌のセルの枠組みの中でドイツ語研究評議会 (DFG) によってサポートされていた"とマックス ・ プランク協会。

1. 準備との成長M. ザンサス系統
注: は、表 1と表 2を参照してください。
<ol><li>カナマイシン (50 μ g/mL) を添加した 10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO422, 1 %casitone スープ (CTT) 成長中 1% (w/v) 膵臓のダイジェスト (例えば、バクト casitone)、カゼインを準備かオキシテトラサイクリン (10 μ G/ml)。それ以来他の細菌による汚染のリスクを減らすためにすべてのメディアにゲンタマイシン (10 μ G/ml) を追加M. ザンサス細胞が自然に耐性があります。</li>
	<li>1 %5 mL を接種する CTT 関連を含む野生の 1 つ新たに育てられた植民地と抗生剤を参照」と入力 (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24SA4797 (ΔmglA、ΔpomX/PpomZ mCherry pomX)16, SA8241 (ΔmglA、 ftsZ+/PnatftsZ-gfp)、または SA4749 (ΔmglA、 parB+/PnatparB-yfp) で、1 日目の朝。<ol>
<li>シングルを再懸濁しますM. ザンサスCTT が生殖不能の管に抗生物質を添加した、全体の懸濁液を 50 mL の三角フラスコを 5 mL の 1% を含むに転送 1 %500 μ L の植民地 CTT。 注: は十分な aeriation と最適な成長を保証するのに 10 回文化のボリュームと三角フラスコを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>220 rpm、暗闇の中で揺れ、32 ° C で 8 世代 (4-6 時間の世代時間約 40-48 h) のセルを育てなさい。急激な成長の段階で細胞を維持 (外径550 < 1.2) 静止した段階に達することからそれらを防ぐためです。必要な場合は、新鮮な 1 %ctt 培 0.1 の OD550に関連する抗生剤を参照に細胞を希釈 - 0.2。 注: 単一細胞顕微鏡用最適外径550は、0.5 - 0.7。この OD550で十分な細胞数により細胞パラメーターの統計的解析と同様に、定量化するイメージごとことがあります。</li>
</ol>2. 顕微鏡用試料の調製
注: 顕微鏡で見られるようにセルを顕微鏡観察に配置して、栄養素を含む agarose パッドでカバーします。Coverslip がプラスチックに接着または機械的に提供するために金属製のフレームをサポートします。顕微鏡検査の準備で、1% の agarose/TPM/0.2% の大きいパッド CTT 準備されるべき事前 2.1 2.3 の手順で説明するように。ここで使用される特定の製品の材料の表も参照してください。
<ol><li>TPM バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.6, 1 mM KH2PO4 pH 7.6, 8 mM MgSO4) の 500 mL を準備し、オートクレーブまたはフィルター滅菌ボトル上部フィルターを使用しています。 注: 滅菌のバッファーは、室温で数ヶ月保存できます。</li>
	<li>1% アガロースゲル顕微鏡 0.2% 溶液を準備 CTT (80 ml の TPM バッファーの 1 %ctt 培地 20 mL 寒天 1 g を混ぜて)。Agarose が溶融するまで電子レンジで加熱します。 注: 0.2 %ctt はセル成長および飢餓を防ぐように十分です。顕微鏡の中で CTT の高濃度は、高いバック グラウンド蛍光になります。</li>
	<li>(11.5 cm × 11.5 cm 角シャーレ、溶融 agarose の約 60 mL が必要です) の 0.5 cm の厚さに溶融の agarose が付いてペトリ皿を記入し、室温まで冷ます。 注: agarose のパッドは 4 ° c 湿度の高い環境で 2 日間保存できます。<ol>
<li>あらかじめ使用前に少なくとも 15 分の 32 ° C で 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドを温めます。 注: 顕微鏡用細胞を準備するには、2.4 2.8 の手順に従います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌ガラス基板を配置 (60 mm × 22 mm、厚さ: 0.7 mm) 中間 (図 1A) に穴があるプラスチックや金属のフレームにこのフレームは薄い coverslip の機械サポートとして機能し、顕微鏡の中にドリフトを低減するのに役立ちます。フレームに coverslip をテープで固定します。<ol>
<li>フレームを準備するには、1 mm の厚さの金属板から 75 mm × 25 mm のフレームをカットし、真ん中に、適切なサイズの穴 (20 mm × 30 mm この実験で) をカットします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>指数関数的に成長の 10-20 μ L を追加M. ザンサス、coverslip のセル。</li>
	<li>マーカとして細胞またはコマ撮り録画で蛋白質の追跡を簡素化する細胞に蛍光の 0.5 μ m の微粒子を追加します。<ol>
<li>TPM バッファー内微小球 1: 100 を希釈し、数ヶ月まで 4 ° C で保存します。使用する前に徹底的に振る、希薄化後の微粒子の 5-10 μ L をセルに追加します。 注: ここで微小蛍光にあるすべての一般的な青、緑、黄色と赤蛍光チャネルが使用されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>大きな予め温めておいた 1% agarose/TPM/0.2% CTT パッドの coverslip のサイズは約小さなパッドをカット、細胞 (図 1B) の上に置きます。蒸発を防ぐために、湿度の高い環境で細胞を維持するために 1% agarose/TPM/0.2% CTT agarose パッド上に coverslip を配置します。 注: coverslip を単独では少なくとも 2 時間の重要な蒸発を防ぐ。コマ撮り録画もう 1% agarose/TPM/0.2% CTT のパッドと coverslip のサンドイッチは、蒸発を防ぐためにパラフィン フィルムでシーリングをします。</li>
	<li>アガロース パッドの下部を付けるセルに 15 〜 20 分のための 32 ° C で顕微鏡サンプルをインキュベートします。微速度顕微鏡観察記録を開始します。</li>
</ol>3. 顕微鏡のセットアップと時間経過の取得
注: ここで説明したプロトコル 100 X オート フォーカス機能付き広視野倒立顕微鏡用に開発された/1.30 NA 油 PH3 目的、X、Y 電動ステージ、sCMOS カメラ、光源、緑色蛍光用フィルター、赤い蛍光または黄色蛍光蛋白質および温度制御培養チャンバー。この室内は、一定温度、光から保護されているセルを保持します。
<ol><li>顕微鏡を開始する前に、インキュベーション室と 1 ~ 2 h の 32 ° C に顕微鏡を予熱します。 注: 顕微鏡のセットアップによっては暖房が時間がかかります。予熱はドリフトの低減が不可欠ですし、オート フォーカス制御システムを安定します。</li>
	<li>顕微鏡を切り替え、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。正しい目標を選択し、正しいミラーおよび取得フィルター相緑蛍光、蛍光、レッドまたは黄色蛍光タンパク質のイメージと同様にコントラストの画像。 注: 顕微鏡は通常顕微鏡制御と画像の獲得のための好みのソフトウェアで提供されます。ここで市販のソフトウェアは、顕微鏡と画像集録を制御する使用された (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>目的の 32 ° C でプレインキュベートしたサンプルの下にレンズの上に高品質のイマージョン オイルの滴を追加します。サンプルは顕微鏡のステージに配置される場合、対物レンズの損傷を避けるために最も低い可能な Z 位置に目的を配置します。顕微鏡ステージ上にサンプル、目的に向かって「穴側」と金属フレームを配置します。ステージ ホルダーにサンプルを安全に固定します。</li>
	<li>目標に近づく Z 方向にステージを移動することによって、細胞に焦点を当てます。オイルはサンプルの下側にしましたが、対物レンズを作る、遅い段階を移動接触。X でステージを移動/複数の単一セルまでの Y 方向は、ビューの領域で可視セルが焦点面で。取得した画像を後で調整するためにビューの領域は、その少なくとも 1 つの蛍光微粒子を確認します。 注: 最適な条件でビュー (2,048 x 2,048 ピクセルまたは 133.1 x 133.1 μ m) の地域ごとの 15-30 セルの細胞密度を達成すべき。</li>
	<li>顕微鏡に必要な場合に複数の波長とステージの位置の画像を取得することができる時間の経過実験を設定する顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを開きます。<ol>
<li>[メイン] タブでは、タイムラプス複数の波長を有効にします。ウィンドウの左側にある追加のタブが表示されます。</li>
		<li>タブの保存と取得した画像を保存するコンピューターのハード ドライブに空のフォルダーを選択するディレクトリの選択]をクリックします。連続データセットは、以前のものを上書きしないことを確認するファイルが存在する場合に基本名をインクリメントをアクティブにします。その後、実験日付と緊張の名前や実験のタイトルに名前を付けます。</li>
		<li>コマ撮りのパラメーターを調整するタイムラプスタブをクリックします。期間は 24 時間に設定し、時間間隔を 20 分に設定します。時間ポイントの数が自動的に変更されます。 注: 最適な時間間隔は、実験と分析対象とする細胞の機能に依存します。頻繁に画像関連の買収は、退色を引き起こす可能性があります。したがって、時間分解能と退色のトレードオフを経験的に見つけられなければなりません。4-6 h の倍加時間で取り込みが可能簡単に 5 分 (またはさらに小さい間隔必要な場合) の間隔で位相差顕微鏡の。24 h の時間経過とともに蛍光顕微鏡の画像は約 15-30 分の間隔で記録する必要がありますが必要なかどうか。</li>
		<li>各時点で各画像の数を変更することによって取得する波長の波長タブをクリックを選択します。 注: 各波長の新しいタブの左側に表示されます、多次元買収"ウィザードと波長を上から下への順序で取得されます。各波長取得設定を個別に変更できます。</li>
		<li>上から最初の波長のタブをクリックします。照明のドロップ ダウン リストで位相コントラストを選択します。露出の 100 ms を選択し、取得のドロップ ダウン リストに毎回ポイントを選択します。ドロップ ダウン リストにしないを選択することで自動公開を無効にします。</li>
		<li>ステップ 3.5.5 各時点で取得する必要があります各波長に対して繰り返します。実験のセットアップと蛍光に分類された蛋白質の説明ここでは、次のパラメーターを使用して露出: mCherry 融合蛋白質を 250 ms、YFP 融合蛋白質を 200 ms、GFP の融合蛋白質の 1,000 ms。 注: ひずみおよび蛍光タンパク質ごとの最適な照明の設定は、ランプの強度と各波長の画像の取込時間を変更することによって事前に決定する必要があります。長すぎる画像集録時間は光毒性の効果を増加し、最終的に成長の逮捕や細胞の死に 。したがって、画像品質と細胞生存率のトレードオフを達成する必要があります。</li>
		<li>同じ実験に記録されているセルの数を増やすの複数のステージ位置からの画像を取得します。<ol>
<li>複数ステージ位置から画像を取得するには、[メイン] タブで複数ステージ位置をアクティブにします。[ステージ] タブをクリックし、ライブをクリックして、ビューのフィールドを見てください。</li>
			<li>利益 (率 ROI) の領域は、ビューのフィールドまで、X ・ Y 方向のステージを移動します。保存、X 座標と Y 座標をクリックして、「+」ステージ] タブでステージを再度移動 X ・ Y 方向の新しい ROI が見つかるまで、座標保存もう一度「+」をクリックします。希望領域数が保存されるまで行きます。 メモ: 蛍光画像の取得の場合、必ず関心 (ROIs) の領域ではないことに近すぎるお互いの光毒性を最小限に抑える。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルに保存されている X-、Y-位置の違いをクリックしては、フォーカスと実験の過程で保存された Z 位置を一定に保つAFC を保持するをクリックしてハードウェアのオート フォーカスを開始するもう一度チェックしてください。</li>
	<li>顕微鏡制御ソフトウエアの多次元取得ウィザードを取得をクリックして時間経過の録音を開始します。 注: 1 つのウィンドウ表示されます各波長を取得して取得した時点で、次の画像を取得するまでの時間数が表示されます追加のウィンドウが表示されます。</li>
	<li>画像の品質を最大化し、必要な場合に焦点を当てる時間経過の録音で最初の数時間ポイント後セルがフォーカスでまだであるを確認します。</li>
</ol>4. コマ撮りムービーや画像の配置の生成
注: いくつかの商業およびフリーソフトのパッケージ、画像取得と画像解析のために利用できます。我々 は市販のソフトウェアを使用して (材料の表を参照) と複数の事前インストールされているプラグインと追加のツール。
<ol><li>画像解析/処理ソフトウェアがインストールされているコンピューターで時間経過の録音から個々 の画像を保存します。</li>
	<li>ソフトウェアを起動し、スタックとしてレビュー多次元データをクリックして画像を開く |基本ファイルを選択 |ディレクトリを選択して。多次元データのフォルダーを開きます。データセットをチェックし、表示をクリックしてくださいデータセットは、時間から 1 つの画像が終了するまで 1 つをポイントとして表示されます。(スタックを作成する) の波長をアクティブに、ロードの画像をクリックしてスタックにするすべての画像を選択します。すべての波長にこの手順を繰り返し、完成したスタックを保存します。</li>
	<li>(省略可能)ファイルを使用して映画に必要なすべてのイメージを開く |オープン。 注: お勧め画像を開く 1 つ買収した波長によって時に計算能力が制限されている場合、コンピューターを遅くしません。時間経過の録音、例えば開始、最後に、またはいくつかの時間ポイントの特定の部分をスキップする必要がある場合、これは完成した映画で調整できます。</li>
	<li>ドリフトを補正する必要があるイメージのスタックを有効にします。アプリで位置合わせツールを開く |. 配置を自動画像と参照平面として初めて平面のポイントのソースとしてチェックスタック。ソース スタック] ボタンでスタックを選択し、[適用] をクリックします。 メモ: 自動配置されます、いくつかの時間や計算パワーですが顕微鏡のセットアップのドリフトのビッグ スタックを修正するための良い方法です。この自動アライメントは、微粒子が含まれますがそれらなしで動作可能性がありますも場合にも動作します。</li>
	<li>アライメントのスタックを保存します。</li>
	<li>・ ロワを使用します。 注: 蛍光タイムラプス顕微鏡は簡単に大きな計算能力の多くを取る、これらの映画の下流の処理が遅くなるデータ ファイルのセットを作成します。したがって強くお勧め・ ロワを識別し、小さいファイルで動作するようにセルを隔離します。<ol>
<li>矩形ツールを選択します。位相コントラスト画像の ROI を手動で描画することによって興味のセルの周り ROI を作成します。興味のセルが表示されている、全体の時間経過映画を通してフォーカスであることを確認します。</li>
		<li>同じデータセットの第 2 波長のコマ撮りムービーを開きます。位相コントラスト画像から蛍光に投資収益率を転送する第 2 波長の画像は、地域で転送領域ツールを使用して |領域を転送。ソース イメージとターゲット イメージとして第 2 波長データセットとして位相コントラスト データセットを選択します。すべての地域を選択し、 [ok]を押します。</li>
		<li>ステップ 4.6.2 同じデータセットの取得各波長に対して繰り返します。</li>
		<li>ROI を選択して編集でスタックとして複製 |重複 |スタック...か、 Shift + Ctrl + Dキーを押します。ファイルで重複したスタックを保存 |保存元のデータと同じフォルダーにします。</li>
		<li>同じデータセットの取得すべての波長の各 ROI について手順 4.6.4</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mov 形式または AVI 形式でムービーを生成するスタック経由でムービーの作成関数を開く |映画を作る。ソース スタック] ボタンと時間経過の録音を選択します。出力フォーマット、フレーム レート、フレームの数を選択し、[保存] をクリックします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shapiro, L., McAdams, H. H., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+bacteria+localize+proteins.">Why and how bacteria localize proteins.</a> Science. 326 (5957), 1225-1228 (2009).</li><li>Treuner-Lange, A., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+polarity+in+bacteria.">Regulation of cell polarity in bacteria.</a> J Cell Biol. 206 (1), 7-17 (2014).</li><li>Laloux, G., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+PopZ+localization+through+cell+cycle-coupled+multimerization.">Spatiotemporal control of PopZ localization through cell cycle-coupled multimerization.</a> J Cell Biol. 201, 827-841 (2013).</li><li>Rudner, D. Z., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+subcellular+localization+in+bacteria.">Protein subcellular localization in bacteria.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (4), 000307 (2010).</li><li>Badrinarayanan, A., Le, T. B. K., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromosome+organization+and+segregation.">Bacterial chromosome organization and segregation.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 31 (1), 171-199 (2015).</li><li>Munoz-Dorado, J., Marcos-Torres, F. J., Garcia-Bravo, E., Moraleda-Munoz, A., Perez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxobacteria:+Moving,+Killing,+Feeding,+and+Surviving+Together.">Myxobacteria: Moving, Killing, Feeding, and Surviving Together.</a> Front Microbiol. 7, 781 (2016).</li><li>Berleman, J. E., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+hunting+strategy+of+a+bacterial+wolfpack.">Deciphering the hunting strategy of a bacterial wolfpack.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (5), 942-957 (2009).</li><li>Konovalova, A., Petters, T., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+biology+of+Myxococcus+xanthus.">Extracellular biology of Myxococcus xanthus.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 89-106 (2010).</li><li>Nudleman, E., Wall, D., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+bacterial+outer+membrane+lipoproteins.">Cell-to-cell transfer of bacterial outer membrane lipoproteins.</a> Science. 309, 125-127 (2005).</li><li>Vassallo, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+polymorphic+toxins+delivered+by+outer+membrane+exchange+discriminate+kin+in+myxobacteria.">Infectious polymorphic toxins delivered by outer membrane exchange discriminate kin in myxobacteria.</a> eLife. 6, 29397 (2017).</li><li>Vassallo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rejuvenation+and+social+behaviors+promoted+by+LPS+exchange+in+myxobacteria.">Cell rejuvenation and social behaviors promoted by LPS exchange in myxobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (22), 2939-2946 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+polysaccharides+mediate+pilus+retraction+during+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Extracellular polysaccharides mediate pilus retraction during social motility of Myxococcus xanthus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5443-5448 (2003).</li><li>Kim, S. K., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+alignment+required+in+differentiation+of+Myxococcus+xanthus.">Cell alignment required in differentiation of Myxococcus xanthus.</a> Science. 249, 926-928 (1990).</li><li>Lobedanz, S., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+C-signal,+a+contact+dependent+morphogen+coordinating+multiple+developmental+responses+in+Myxococcus+xanthus.">Identification of the C-signal, a contact dependent morphogen coordinating multiple developmental responses in Myxococcus xanthus.</a> Genes Dev. 17, 2151-2161 (2003).</li><li>Schumacher, D., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+polarity+in+motility+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of cell polarity in motility and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Annu Rev Microbiol. 71 (1), 61-78 (2017).</li><li>Schumacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PomXYZ+proteins+self-organize+on+the+bacterial+nucleoid+to+stimulate+cell+division.">The PomXYZ proteins self-organize on the bacterial nucleoid to stimulate cell division.</a> Dev Cell. 41 (3), 299-314 (2017).</li><li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PomZ,+a+ParA-like+protein,+regulates+Z-ring+formation+and+cell+division+in+Myxococcus+xanthus.">PomZ, a ParA-like protein, regulates Z-ring formation and cell division in Myxococcus xanthus.</a> Mol Microbiol. 87 (2), 235-253 (2013).</li><li>Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+systems+for+conditional+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus+inducible+by+isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside+or+vanillate.">Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate.</a> J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).</li><li>Harms, A., Treuner-Lange, A., Schumacher, D., S&#248;gaard-Andersen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+chromosome+and+replisome+dynamics+in+Myxococcus+xanthus.+reveals+a+novel+chromosome+arrangement.">Tracking of chromosome and replisome dynamics in Myxococcus xanthus. reveals a novel chromosome arrangement.</a> PLoS Genet. 9 (9), 1003802 (2013).</li><li>Iniesta, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParABS+system+in+chromosome+partitioning+in+the+bacterium+Myxococcus+xanthus.">ParABS system in chromosome partitioning in the bacterium Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 9 (1), 86897 (2014).</li><li>Lin, L., Osorio Valeriano, M., Harms, A., S&#248;gaard-Andersen, L., Thanbichler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactofilin-mediated+organization+of+the+ParABS+chromosome+segregation+system+in+Myxococcus+xanthus.">Bactofilin-mediated organization of the ParABS chromosome segregation system in Myxococcus xanthus.</a> Nat Commun. 8 (1), 1817 (2017).</li><li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+stimulation+of+movement+in+nonmotile+mutants+of+Myxococcus.">Cell-to-cell stimulation of movement in nonmotile mutants of Myxococcus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (7), 2938-2942 (1977).</li><li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+gliding+is+correlated+with+the+presence+of+pili+in+Myxococcus+xanthus.">Social gliding is correlated with the presence of pili in Myxococcus xanthus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (11), 5952-5956 (1979).</li><li>Miertzschke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+the+Ras-like+G+protein+MglA+and+its+cognate+GAP+MglB+and+implications+for+bacterial+polarity.">Structural analysis of the Ras-like G protein MglA and its cognate GAP MglB and implications for bacterial polarity.</a> EMBO J. 30 (20), 4185-4197 (2011).</li><li>Hodgkin, J., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+gliding+motility+in+Myxococcus+xanthus.+(Myxobacterales):+Two+gene+systems+control+movement.">Genetics of gliding motility in Myxococcus xanthus. (Myxobacterales): Two gene systems control movement.</a> Mol Gen Genet. 171, 177-191 (1979).</li><li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+and+experimental+analysis+of+proteins+of+two-component+systems+in+Myxococcus+xanthus.">Bioinformatics and experimental analysis of proteins of two-component systems in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 190 (2), 613-624 (2008).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354 (6349), 161-164 (1991).</li><li>Lutkenhaus, J., Pichoff, S., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cytokinesis:+From+Z+ring+to+divisome.">Bacterial cytokinesis: From Z ring to divisome.</a> Cytoskeleton. 69 (10), 778-790 (2012).</li><li>McLoon, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MglC,+a+Paralog+of+Myxococcus+xanthus+GTPase-Activating+Protein+MglB,+Plays+a+Divergent+Role+in+Motility+Regulation.">MglC, a Paralog of Myxococcus xanthus GTPase-Activating Protein MglB, Plays a Divergent Role in Motility Regulation.</a> J Bacteriol. 198 (3), 510-520 (2015).</li><li>Gomez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+set+of+integrative+plasmid+vectors+for+copper-inducible+gene+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Comprehensive set of integrative plasmid vectors for copper-inducible gene expression in Myxococcus xanthus.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2515-2521 (2012).</li><li>Treuner-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+G-protein+MglA+connects+to+the+MreB+actin+cytoskeleton+at+bacterial+focal+adhesions.">The small G-protein MglA connects to the MreB actin cytoskeleton at bacterial focal adhesions.</a> J Cell Biol. 210 (2), 243-256 (2015).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

蛍光住セルイメージ投射細菌細胞の時空間ダイナミクスを研究するための強力なツールとなっています。運動と遅い成長する細菌などのタイムラプス蛍光顕微鏡M. ザンサス、しかし、挑戦されている、短時間に行っただけ。今回の生きているセルイメージ投射のための簡単に使用できる、堅牢なメソッドM. ザンサスタイムラプス蛍光顕微鏡による。このメソッドでは、セルおよび単一セルの解像度による細胞周期のいくつかのラウンドの蛍光に分類された蛋白質に従うことができます。
成長が遅いの住セルイメージ投射の成功に影響を与えるいくつかの前提条件があるM. ザンサスを含む細胞: 1) 細胞接着のための固体表面2) 栄養素や酸素の空室状況3) 一定の湿度と温度;・ 4) 露出時間と画像の取得頻度などの実験条件の最適化。
私たちの実験設定栄養素を添加した agarose の厚いパッドを使用します。単一のセルに従う厚いアガロース マイクロ流体デバイスではなくパッドを使用するいくつかの基本的な利点がいくつかの欠点もあります。まず、アガロース パッドの表面だけでなくM. ザンサス添付ファイルや運動だけでなく、少なくとも 24 時間の成長のための十分な栄養素を細胞します。第二に、スナップ ショット分析一般的蛍光に分類された蛋白質の細胞内局在性を研究するために使用以前同じタイプのアガロース パッド16,17,29に行われていた。したがって、ここで説明した方法で得られるデータをスナップ ショット分析からデータを直接比較できます。第三に、アガロース パッドを簡単に変更および抗生物質や CuSO4などの他のサプリメントを補充することができます、バニリン酸一般的に使用される遺伝子発現誘導18,30。最後に、細胞は実験の過程でフォーム microcolonies を許可するためこの設定できますを分析して特定のパラメーターに直接細胞間相互作用の効果を勉強します。この側面の場合特に重要ですM. ザンサスこの細菌はいくつかの接触依存性相互作用を表示するため。このメソッドの主な欠点は、実験期間中に実験条件を事前設定です。対照的に、マイクロ流体デバイスは一般に実験の過程で例えば抗生物質31を追加して実験条件を変更できます。
フリー ソフトウェア パッケージ (例えばMicrobeJ、Oufti) が自動的に単一細胞および細胞内蛋白質のローカリゼーションの拡張の分析に使用できます。ただし、これらのソフトウェアは、のみ単一のセルまたはセルの小さいグループの分析に適しています。したがって、ここで説明した 24 h 録画用に生成されたデータを自動的に分析する課題が残った。
要約すると、成長が遅いと住セルイメージ投射を実行する簡単に使用できる、再現可能なプロトコルについて述べるM. ザンサス細菌。単純な栄養添加 agarose パッドが少なくとも 24 時間成長を維持し、観察し、蛋白質のローカリゼーション、数世代にわたって単一セルの解像度と成長の分析を可能にするための十分なことを示します。

細菌細胞、空間的非常に多くの蛋白質の細胞コンパートメント1,2,3,4内で非対称的にローカライズする組織します。このローカリゼーションがしばしば非常に動的および細胞周期上の手掛かりまたは外部信号への応答に時間をかけて変更します。同様に、細菌の染色体は空間的高前に、と分離プロセス5中に細胞内の特定の場所に配置されている個々 の遺伝子座で構成されています。このダイナミックな空間組織は重要な成長、部門、細胞周期制御、分化、運動、シグナル伝達と同様、染色体組織と偏析;したがって、細菌の機能の本質的にすべての側面に影響します。
大腸菌枯草菌、コレラ菌、およびCaulobacter crescentus提供に重要な別の細菌種の様々 なこれらの細胞プロセスの時空間ダイナミクスを分析しています。モデル生物。ただし、これらの 4 種は、巨大な細菌の多様性の小さいスペクトルだけをカバーし、細胞組織と偏波のメカニズムはおそらくこれらの種の大規模な系統学的距離を考えると当然のことながら、これらが異なります細菌。これは、最終的に細菌細胞の時空間ダイナミクスの基礎となる原則を抽出できるようにする追加の細菌種の勉強の必要性を発生させます。
グラム陰性のデルタ proteobacterium M. ザンサスは社会的行動の研究のモデル生物、細菌6に協力。M. ザンサス厳密な好気性生物であり、栄養素の存在下で細胞が外側に非常に組織的で、群がってファッション、7他の微生物の餌に広がりのコロニーを形成します。栄養飢餓に応じて、セルを開始これは、内部細胞の何千もので構成される子実体の形成に結果発達プログラム棒状運動細胞分化に球形二倍体の胞子8。動作、すなわち、群がっておよび子実体形成の両方のタイプは、固体表面上に置かれた細胞によってのみ実行されます。さらに、両方の栄養条件下で細胞は、直接細胞間の接触運動を刺激する可能性がありますまたは受信者9,10 の毒素として機能する外膜リポ蛋白の交換を含むを含むプロセスに従事します。、12、細胞の LPS11、近隣のポリサッカライドによる運動の刺激の交換、細胞間シグナル伝達、細胞表面アンカー型蛋白質13,14をシグナリングします。
最近では、 ・ m ・ クサントス運動とその規制15、細胞分裂16,17,18, および染色体組織19 の基になるメカニズムを研究するためのモデル生物にもなっています。 ,20,21。重要なステップ、 ・ m ・ クサントス細胞周期は、関連の蛍光に分類された蛋白質16,を運ぶ緊張のスナップ ショット画像や短い時間経過の録音を使用して蛍光顕微鏡で詳細に分析されている17,18,19,20。理想的には、多くの細胞は蛍光ライブセル イメージング細胞周期パラメーターの堅牢な定量的データを取得する、少なくとも 1 つの完全細胞周期によって単一セルの解像度と従ってください。ただし、これは挑戦の場合M. ザンサス標準実験室の条件の下で 4-6 時間の比較的長い世代時間および fluorophores が付いて、画像集録中に光毒性の退色原因。
ここに従うプロトコルについて述べるM. ザンサス蛍光ライブ-細胞少なくとも 24 h の画像といくつかの細胞周期をカバーによって単一セルの解像度を持つセル。重要なは、プロトコル全体の中に細胞は寒天パッドに維持され、近くでの社会生活に欠かせない接触依存性活動を可能にするにお問い合わせくださいM. ザンサス。プロトコルは、高時間分解能と単一セルの解像度、モニターの形状、サイズ、部門、および蛍光プローブをユーザーができます、したがって、有効に細胞間変動の定量化と細胞周期イベントの相関関係。

<table><tbody><tr><td>DMI6000B with AFC</td><td>Leica microsystems</td><td>11888945</td><td>Automated inverted widefield fluorescence microscope with adaptive focus control</td></tr><tr><td>Universal mounting frame</td><td>Leica microsystems</td><td>11532338</td><td>Stage holder for different sample sizes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3</td><td>Leica microsystems</td><td>11506197</td><td>Phase contrast objective</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 camera</td><td>Hamamatsu</td><td>11532952</td><td>4.0 megapixel sCMOS camera for picture aquisition</td></tr><tr><td>Filter set TXR ET, k</td><td>Leica microsystems</td><td>11504170</td><td>Fluorescence filter set, Ex: 560/40 Em: 645/75</td></tr><tr><td>Filter set L5 ET, k</td><td>Leica microsystems</td><td>11504166</td><td>Fluorescence filter set, Ex: 480/40 Em: 527/30</td></tr><tr><td>Filter set YFP ET, k</td><td>Leica microsystems</td><td>11504165</td><td>Fluorescence filter set, Ex: 500/20 Em: 535/30</td></tr><tr><td>ProScan III&amp;nbsp;</td><td>Prior</td><td>H117N1, V31XYZEF, PS3J100</td><td>Microscope automation controller with interactive control center</td></tr><tr><td>EL 6000 light source</td><td>Leica microsystems</td><td>11504115</td><td>External fluorescence light source</td></tr><tr><td>Incubator BLX Black</td><td>Pecon</td><td>11532830</td><td>Black incubation chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Tempcontrol 37-2 digital</td><td>Leica microsystems</td><td>11521719</td><td>Automated temperature control for incubation chamber</td></tr><tr><td>Gentmycin sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>0233.4</td><td>Gentamycin</td></tr><tr><td>Oxytetracylin dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201-212-8</td><td>Oxytetracyclin</td></tr><tr><td>Kanamycin sulphate</td><td>Carl Roth</td><td>T832.3</td><td>Kanamycin</td></tr><tr><td>Filtropur BT25 0.2 bottle top filter</td><td>Sarstedt</td><td>831,822,101</td><td>Bottle top filter for sterilization of buffers</td></tr><tr><td>Deckgl&amp;auml;ser</td><td>VWR</td><td>630-1592</td><td>Glass cover slip (60 x 22 mm, thickness: 0.7 mm)</td></tr><tr><td>Seakem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Agarose for microscopy slides</td></tr><tr><td>Leica Metamorph AF</td><td>Leica microsystems</td><td>11640901</td><td>Microscope control software and software for picture analysis</td></tr><tr><td>Tetraspeck Microsperes, 0.5 &amp;micro;m</td><td>ThermoFisher</td><td>T7281</td><td>Fluorescent microspheres</td></tr><tr><td>petri dish</td><td>Greiner Bio-one</td><td>688102</td><td>120 mm x 120 mm x 17 mm squared petri dish for agarose pads</td></tr><tr><td>BD Bacto Casitone</td><td>Becton Dickinson</td><td>225930</td><td>Casitone</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Carl Roth</td><td>AE15.2</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate heptahydrate</td><td>Carl Roth</td><td>P027.2</td><td>Magnesium sulphate</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate p.a.</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>Potassium dihydrogen phosphate</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1% CTT medium:&lt;/strong&gt; 1 % (w/v) BD Bacto&amp;trade; casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Cultivation medium for M.xanthus</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TPM buffer:&lt;/strong&gt; 10 mM Tris-HCl ph 8.0, 1 mM potassium phosphate buffer pH 7.6, 8 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Buffer for preparation of microscopy slides for M.xanthus</td></tr></tbody></table>

fluorescence live-cell imaging of the complete vegetative cell cycle of the slow-growing social bacterium myxococcus xanthus

細菌細胞の蛍光住セルイメージ投射は、タンパク質と中央細胞周期イベントの基になる染色体の時空間ダイナミクスの解析に重要なメソッドです。ただし、画像の取得中には、成長の遅い細菌のこれらの分子のフルオロおよび光毒性のフォトブリーチングによる挑戦をイメージング。ここでは、 Myxococcus クサントス(4-6 時間の世代時間のある) 場合にこれらの制限を回避するための単純なプロトコルについて述べる。このため、 M. ザンサスセル、厚い栄養素を含む寒天パッド温度制御の湿気の多い環境で育ちます。これらの条件の下で単一のセルの成長に従って個々 の細胞の倍加時間を決定します。また、キー携帯処理で ParB YFP、FtsZ GFP、mCherry PomX など関連するマーカーの蛍光に分類された蛋白質を含んでいる細胞の蛍光住セルイメージ投射によって視覚化される染色体分配と細胞分裂など細胞周期。その後、取得したイメージは、モンタージュおよび/または映画を生成する処理されます。

M. ザンサス固体表面上に移動遅い成長している細菌です。我々 の実験の設定をテストするため運動性 DK1622 WT 細胞タイムラプス実験を行った。位相コントラスト画像に 24 h (図 2A、B) の 5 分の間隔で買収されました。セルの大半はグループに配置されます。予想通り、細胞運動を表示し、グループで主に移動します。さらに、細胞が時折運動の方向を逆転を観察しました。これらの所見は、テスト条件下で WT 細胞が細胞の運動性の面で正常に動作します。しかし場合でも、細胞は、5 分ごとに記録され、個々 の細胞の同定は難しいです。さらに、細胞は運動なので多くの細胞は脱出か長時間セルを従うこと困難にビューのフィールドを入力します。
同じを追跡するためにM. ザンサス細胞運動25のために不可欠であるmglA遺伝子の生細胞イメージングによる細胞周期のいくつかのラウンドの個々 の緊張を削除できます。これは細胞がイメージング プロトコル間の視野の外に移動することを防ぎます。フレームの削除は、市らで説明されているように生成されます。26
位相コントラスト住セルイメージ投射非運動性 ΔmglA細胞 (図 3) と、期待どおりにセルにアクティブな動きが表示されませんでした。コロニー形成の間に個々 の細胞の分裂や成長することができました。24 時間 5 分の間隔で得られた画像をコマ撮りの記録に基づいて、単一セルの解像度と interdivision 時間 (細胞分裂の 2 つのイベント間の時間) を定量化することが可能だった。ΔmglA変異体の細胞は 235 ± の間部門時間 50 分 (n = 97 細胞)。約 4 時間の interdivision 時間は WT 細胞懸濁培養における測定倍加時間と同様です。これは、証拠を提供しますM. ザンサス細胞成長これらの実験条件下で最適。
蛍光タイムラプス イメージングを行った私たちの設定が通常は長期間にわたって YFP 標識タンパク質を追跡しながら成長する細胞をできるかどうかを調べるには、 ・ m ・ クサントスYFP タグ付きタンパク質を発現する細胞。このため、レプリケーション (ori) の起源のためのマーカーとして ParB YFP を続きます。ParABSシステムのコンポーネントとしては、ParB M. ザンサス ori; に近位部サイトにバインドとしたがって、原点の複製と染色体の分離は、続いて19,20,21をすることができます。画像集録 (位相差顕微鏡および蛍光、YFP チャンネルで 200 ms のアクイジション時間) 20 分毎、細胞成長、分割、24 h (図 4A) でも成長を表示しました。録音開始時 ParB YFP は細胞 (図 4A) の大半の亜寒帯地域に 2 つのクラスターを形成しました。亜寒帯 ParB YFP クラスターの重複して古い細胞極に直前にまたは細胞分裂後。2 つのクラスターの 1 つは、2 番目のコピーは約 40-60 分 (図 4a, B) 後に最終的な亜寒帯位置に達し、新しい細胞極転しながら古い細胞極にとどまっています。これらの観察は、薄い寒天パッド19を使用して短い時間経過の録音から生成された前のデータと一致しています。この実験的 set-up 遅い成長にいくつかの細胞周期にわたって染色体分配を追跡する蛍光タイムラプス顕微鏡を終えてM. ザンサス摂動の細胞の成長や染色体分離機械なしのセル。
同様の実験では、タイムラプス蛍光顕微鏡による細胞分裂のためのマーカーに従うことを求めた。ほぼすべての他の細菌と同様M. ザンサス細胞分裂16,17,18の FtsZ の細菌のチューブリンのような gtp アーゼが必要です。FtsZ は、midcell、いわゆる Z リング、細胞分裂27,28に必要なすべての他の蛋白質を募集することでリング状の構造を形成します。M. ザンサス、Z リングと midcell でその位置の形成は 3 つの PomXYZ 蛋白質16,17によって刺激されます。これらの 3 つのタンパク質は、「母」細胞の細胞分裂サイトから 2 つの娘細胞核中に、核様体の間で転送する染色体関連の複合体を形成します。核様体の中央は PomXYZ 複雑な新兵 FtsZ 染色体分配とここでする前に、midcell と一致して Z リング形成を刺激します。
ここでは、我々 はまずftsZ gfpを発現する非運動性細胞を追った。弱い蛍光信号 ParB-YFP より露光時間を 5 倍増加我々 FtsZ GFP 全体ショー 1 GFP チャネルで s。予想通り、FtsZ GFP の強力な蓄積はのみ midcell で認め、この局在決定くびれ細胞分裂 (図 5A) の位置。FtsZ GFP は主に長いセルに midcell でクラスターを形成します。また、このクラスターが時間の経過とともに強度の増加は明らかだった。細胞分裂後、約 2 時間後 (図 5B) を 2 つの娘の midcell で再蓄積 FtsZ GFP に細胞を観察した.これはセル人口の約 50% が FtsZ ローカリゼーションを midcell スナップ ショット分析16,17に基づく表示見つけると一貫性が。
2 番目の実験では、 mCherry pomXを発現する 24 h の非運動性 ΔmglA細胞を追ったPomXYZ システムの一環として、PomX は、それによって midcell16で細胞分裂を刺激 Z リング形成と位置決めのガイドに役立ちます。MCherry PomX の蛍光信号が強いと 250 さんの蛍光チャネルの重要な露出時間をことができます、すべてのセルのサイズが増加したし、24 h (後 microcolonies を形成、実験の過程での細胞分裂のイベントを表示図 6A)。以前に報告された16としては、ほとんどすべての細胞は、mCherry PomX クラスターを含まれています。Midcell、midcell の実験の過程で midcell に転流からクラスターに局在したこれらの大半。細胞分裂中に mCherry PomX クラスターは、クラスターを受け取る各娘細胞に分割されました。FtsZ 遺伝子の発現ではなく mCherry PomX は細胞周期の midcell の 80-90% でローカライズし、細胞分裂 (図 6B) 後すぐにこの位置に達した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig1.jpg"> 図 1: この研究を通して使用実験のセットアップのスケマティック。(A) A 金属またはプラスチック フレームをサンプルのサポートとして提供しています。観察は、サンプルの動きを減らすためにテープで金属製のフレームに固定されます。(B) 側は実験サンプル セットアップの表示します。(A) に示す coverslip の上にマウントされています。栄養素と細胞に湿度を供給する agarose パッドは、セルの上に配置されます。アガロース パッドは、蒸発を減らす追加 coverslip で覆われています。高品質の画像、100 X オイル浸漬位相コントラスト目的が使用されます。<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig2.jpg"> 図 2: 位相コントラスト WT のタイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。細胞が 24 時間続いていたし、画像は 5 分毎に (A) を取得した同じフィールド ビューの 5 分ごとの代表的な画像が表示されます。色付きの矢印は、個々 のセルの移動の方向性を示します。同じ色は、時間の経過とともに同じセルをマークします。数字は分単位の時間を示します。スケール バー: すべての時間後のビューの同じフィールドの 5 μ m. (B) 画像が表示されます。ビューの同じフィールドが表示されますが、セルは移動なので細胞が絶えず出入りするビューのフィールドに注意してください。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. PH: 位相コントラスト。<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig3.jpg"> 図 3: 位相コントラスト非運動性の微速度顕微鏡観察M. ザンサスセル。ΔmglAセル後 24 時間の画像が 5 分ごとに取得し、時間ごとに代表的な画像が表示されます。選択した細胞分裂の狭窄部は、オレンジの矢印が付いています。数字は、時間の時間を示します。PH: 段階の対照。<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig4.jpg"> 図 4: 非運動性で ParB YFP の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサス細胞。ΔmglA変異発現 parB yfpネイティブparB (SA4749; ΔmglA; 存在下での細胞parB+/PnatparB-yfp) 位相コントラストと蛍光顕微鏡が 24 時間続いていた。20 分毎に買収された (A) 画像と位相コントラストのオーバーレイと、YFP の信号と位相 (PH) で 24 時間の画像が表示されます後は、同じセルと共に、10 h が表示されますまでの代表画像 1 時間ごと。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白と緑の矢印は、通過のクラスターをマーク緑色の矢印と ParB YFP クラスターの重複イベントを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) イメージは (A) のように買収されたが、高い時間分解能で表示されます。数字は分単位の時間を示します。矢印は、(A) のようにです。スケール バー: 5 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig5.jpg"> 図 5: 非運動性で FtsZ GFP の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。ネイティブftsZ (SA8241; ΔmglA; の存在でftsZ gfpを発現する ΔmglA変異体の細胞ftsZ+/PnatftsZ-gfp) 位相コントラストと蛍光顕微鏡が 24 時間続いていた。(A) の画像が 20 分毎に取得し代表的な画像 10 h まで 1 時間おきのとおり、位相コントラストと gfp のオーバーレイと位相 (PH) で 24 時間後の同じセルと共に画像が表示されます。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白い矢印は、midcell で FtsZ GFP クラスターを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) イメージは (A) のように買収されたが、高い時間分解能で表示されます。数字は分単位の時間を示します。緑と白の矢印はそれぞれ左と右のセルの FtsZ GFP クラスターをマークします。オレンジ色の矢印は、細胞の分裂を示しています。スケール バー: 5 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57860/57860fig6.jpg"> 図 6: 非運動性で mCherry PomX の蛍光タイムラプス顕微鏡M. ザンサスセル。非運動性 ΔpomX細胞 mCherry PomX (SA4797; ΔmglA; ΔpomX/PpomZ mCherry pomX) を集積が位相コントラストと蛍光顕微鏡 (A) 20 分ごとに 24 時間続いていた代表的な10 時まで 1 時間ごとに表示されるイメージ、位相差顕微鏡および mCherry のオーバーレイと位相 (PH) で 24 時間後の同じセルと共に画像を示す信号。選択した細胞の分裂は、オレンジの矢印が付いています。白と緑の矢印は前に、と後のイベントをそれぞれ分割 mCherry PomX クラスターを示しています。数字は、時間の時間を示します。スケール バー: 5 μ m. (B) 画像 (A) のように買収され、高い時間分解能で表示されます。矢印は、(A) のようにです。スケール バー: 5 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57860/57860fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>菌株</td>
			<td>関連する遺伝子型1</td>
			<td>参照</td>
		</tr>
<tr>
<td>DK1622</td>
			<td>野生型</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>SA4420</td>
			<td>ΔmglA
</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>SA4749</td>
			<td>ΔmglA; parB+/attB:: PnatparB yfp (pAH7)</td>
			<td>この研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>SA4797</td>
			<td>ΔmglA;ΔpomX/attB::PpomZ mCherry pomX (pAH53)</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>SA8241</td>
			<td>ΔmglA; ftsZ+/mxan18 19::PnatftsZ gfp (pDS150)</td>
			<td>この研究</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">プラスミドかっこで示された遺伝子の融合を含むとゲノムで示されているサイトの [附属されました。 AttBサイトにおける総合的なプラスミッドまたはmxan18 19遺伝子間領域から表現されました。 ネイティブ プロモーター (Pnat) または pomZ (PpomZ) のネイティブのプロモーター。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: この研究で使用される細菌のリスト。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>プラスミド</td>
			<td>関連する特性</td>
			<td>参照</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAH7</td>
			<td>PnatparB yfp;Mx8 attP;テトR
</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAH53</td>
			<td>PpomZ mCherry pomX;Mx8 attP ;KmR
</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>pDS150 1
</td>
			<td>PnatftsZ gfp 。mxan18-19 ;テトR
</td>
			<td>この研究</td>
		</tr>
<tr>
<td>pMR3691</td>
			<td>バニリン酸誘導性遺伝子の発現プラスミド</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>pKA51</td>
			<td>PnatftsZ gfp 。Mx8 attP;テトR
</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">1 pDS150: pDS150 mxan18 19遺伝子間領域に置き換えられましたMx8 attPサイトの pKA51 の誘導体であります。 このためmxan18 19遺伝子間領域 Mxan18 19 fwd BsdRI プライマーと pMR3691 から増幅されました。 (GCGATCATTGCGCGCCAGACGATAACAGGC) および Mxan18 19 rev BlpI (GCGGCTGAGCCCGCGCCGACAACCGCAACC) と pKA51 に複製されました。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: この研究に供するプラスミドのリスト。

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus at JoVE.com

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

細菌細胞は空間的非常に組織されます。遅い成長Myxococcus ザンサスセルに時間をかけてこの組織に従う、数世代にわたって高時空間分解能を持つ蛍光住セルイメージ投射のためのセットアップが開発されました。このメソッドを使用して、染色体分配と細胞分裂に重要なタンパク質の時空間ダイナミクスを決定でした。

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

fluorescence-live-cell-imaging-complete-vegetative-cell-cycle-slow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

9.4K ビュー.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology. 細菌細胞は空間的非常に組織されます。遅い成長Myxococcus ザンサスセルに時間をかけてこの組織に従う、数世代にわたって高時空間分解能を持つ蛍光住セルイメージ投射のためのセットアップが開発されました。このメソッドを使用して、染色体分配と細胞分裂に重要なタンパク質の時空間ダイナミクスを決定でした。

ビデオ: Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

免疫・感染学

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました<em&gt;クラミジア</em生細胞内&gt;液胞の成長ダイナミクス

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング<em&gt; S。ベネズエラ</emマイクロ流体デバイスの使用&gt;ライフサイクル

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of signals to create complex, dynamic patterns as a response to environmental cues. These patterns are self-organizing and emergent; they cannot be predicted by observing the behavior of the individual cells. Using a time-lapse microcinematography tracking assay, we identified a distinct emergent pattern in M. xanthus called chemotaxis, defined as the directed movement of a swarm up a nutrient gradient toward its source 1.
In order to efficiently characterize chemotaxis via time-lapse microcinematography, we developed a highly modifiable plate complex (Figure 1) and constructed a cluster of 8 microscopes (Figure 2), each capable of capturing time-lapse videos. The assay is rigorous enough to allow consistent replication of quantifiable data, and the resulting videos allow us to observe and track subtle changes in swarm behavior. Once captured, the videos are transferred to an analysis/storage computer with enough memory to process and store thousands of videos. The flexibility of this setup has proven useful to several members of the M. xanthus community.

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

To study Myxococcus xanthus swarm behavior, we have designed a time-lapse microcinematography protocol that can be modified for different assays. It employs standard growth conditions adapted for microscopy, and yields reproducible results by the use of inexpensive, reusable silicone gaskets. We have used this method to quantify multicellular chemotaxis.

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

生物学

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

視覚化し、定量化するために蛍光タンパク質を使用しました

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

微生物細胞の成長に不可欠なプロセスを遵守する細胞蛍光顕微鏡をライブします。

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討