私たちの仕事は、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会によってサポートされています。私たちは、親切にCFP-LC3の発現用プラスミドを私達に供給するための教授吉森保に感謝したいと思います。

1。細胞調製<ol><li> （2の後の80％の密集度を目指す30〜40％のコンフルエントになるまで、ダルベッコ改変イーグルの培地（DMEM）中で一晩培養細胞、HEK-293T細胞の種低継数が安定的に22ミリメートルの円形のカバースリップ上GFP-DFCP1を表現日 - ライブセルイメージングの日）。 </li></ol> 2。細胞トランスフェクション<ol><li>私は血清培地、3μl​​のX-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬、及びpECFP-LC3プラスミドDNA0.5μgのを減少させ、100μlのOptiMEM中を含む、各プレートのためにトランスフェクション複雑なミックスを調製する。とを上下にピペッティングにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。 [注：我々は何度もそのようなリポフェクトアミン2000などの他のトランスフェクション試薬は、毒性の多くを持っていることを発見した、そして、それに加えて、彼らは多くの顕微鏡技術と干渉し、自分の上に蛍光粒子を生成します。] </li><li>プレートから培地を吸引し、新鮮なDMEM予め温め37℃を追加</li><li> TRANを追加ピペッティングにより細胞への複雑なsfection、24時間インキュベートした細胞。 </li></ol> 3。オルガネラマーカー（オプション）を持つセル·インキュベーション<ol><li> 75 nMの最終濃度DMEMにmitotracker / lysotrackerを追加し、露光、繰り返し凍結融解サイクルを避けるために、全体の実験日に沿って、アルミホイルで覆いファルコンチューブに、氷上で保持する。 </li><li> mitotracker / lysotracker含有培地2mlのアリコートを取り出し、37℃で温める。トランスフェクトした細胞から吸引培地とmitotracker / 30用培地とインキュベート細胞含有lysotrackerと交換 - 60分。 </li></ol> 4。生細胞イメージングのためのインキュベーションチャンバー（図1）の調製<ol><li>きれいな金属、75％エタノールでOリングプラスチックと金属Oリングのリム上にシリコングリースを塗布してください。 </li><li> 、プレートからカバーガラスを除去し、カバースリップの下側から媒体の過剰の乾燥鉗子を使用してこれは漏れの可能性を増加させるように、グリースが多すぎる培地を混合しないようにします。 </li><li>密閉チャンバーを作成するために、プラスチック製のOリングの棚の上に休ませ、その間に挟まれたカバースリップで、プラスチック製のOリングの上に金属製のOリングに合うようにカバースリップのままにしておきます。 </li><li>プレートから媒体とチャンバアップトップ、この点から上に、DMEMの重炭酸塩緩衝系は人工的なCO 2濃度を必要とするように、発生するpHの変化を防ぐために、緩衝剤を含まないDMEM培地での細胞の長期のインキュベーションを避ける5〜10％の、周囲の空気のCO 2濃度が非常に低い。 </li></ol> 5。細胞の飢餓<ol><li>顕微鏡ステージ上でインキュベーションチャンバーを置く。 </li><li>完全培地を吸引しないアミノ酸が、最終的にオートファジー応答を阻害するDMEMから、残っていないことを確実にするために、飢餓培地2mlで3回洗浄する。設定ONタイマー。 </li></ol> 6。顕微鏡検査<ol><li>生細胞広視野落射用に構成されている適切なイメージング·システムが必要となる。これは、典型的には研究用倒立顕微鏡フレーム、蛍光タンパク質（単数または複数）/その他の染料（単数または複数）、高品質の対物レンズ、敏感なCCD / sCMOSに特異強烈な広域スペクトル光源、ミラーおよびフィルタを含む。カメラとインキュベーションチャンバー。 （すべての主要顕微鏡メーカーはライブセルイメージングに適した完全な広視野システムを提供していますが、それはメーカーの様々なコンポーネントを使用してシステムを家庭構築もすることが可能であり、そのようなマイクロマネージャーなどのオープンソースソフトウェアを使用してそれを制御<a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">します。http / / valelab.ucsf.edu /〜MM / MMwiki /</a> ）。我々の意見で最も重要な側面は、蛍光レポーターの発現レベルを最小限に抑えることができるように高感度のシステムを使用することである。 </li><li> SEL画像に適切なセルをecting。 <ol><li>もっとオートファゴソーム形成のイベントをキャプチャできるようになります大規模でフラットなセルを選択します。また、すでにomegasomesより多くの生産を開始した細胞を選ぶ。 </li><li>ビデオあたりオートファゴ形成事象のより大きな割合を捕捉するためには、30分後またはウェルファジー応答にビデオキャプチャを開始する。 </li></ol></li><li>イメージング。 <ol><li>高倍率レンズ（100×1.4 NA）を使用します。 </li><li>光退色を防止するために最大の10〜20％の励起光の強度を調整する。 </li><li> 100〜500ミリ秒の露出、2x2のビニングと100ゲインにカメラ（浜松ORCA ER、画素サイズ6.45μm）を設定します。 </li><li>画像取得速度1フレーム毎に10秒に設定します。 </li></ol></li></ol> 7。 ImageJのとオートファゴソーム形成イベントのモンタージュを作成する [これは、単に電子ためにマージされた映像をスキャンして非体系的な方法で行うことができる興味のある通気孔が、以下に概説するように、それはまた、体系化することができます。] <ol><li> ImageJの/フィジーの3（または2）キャプチャチャネルのためのオープン画像スタック。 </li><li>対応するチャンネルに、赤、緑、青のLUT（ルックアップテーブル）を適用し、3色をマージし、保存します。 </li><li>分析]タブから、[ツール]&gt; [ROIマネージャー]を選択します... &gt;指定し、スタックの最初の画像で定義されたサイズのランダムな領域を選択します。 </li><li> [イメージ]タブから、スタックの選択領域を複製するために、複製を選択します。 </li><li> [イメージ]タブで、[スタック]を選択&gt; [モンタージュを作る...キャプチャされたすべてのフレームを含む暫定的なモンタージュを作成します。完全なオートファゴソーム形成のイベントのモンタージュのすべてのフレームをスキャンし、イベントの最初と最後のフレームのノートを保つ。 </li><li>分析]タブから、[ツール]&gt; [ROIマネージャー]を選択します...他の2色のためだけでなく、マージされた色のイメージと重複してスタックのスタックの最初の画像で同じ領域を選択します。 </li><li> Tから彼はタブをファイル、[新規]&gt; [イメージ]を選択し、高さに設定されたROIマネージャを使用して最初に選択されたピクセルの数に応じた幅に設定されて4回ROIマネージャで設定した高さに加え、3色との間のスペースのために3ピクセル各スタック内のフレーム数として合併し、設定スライス。 </li><li> [イメージ]タブから、[スタック]&gt; [ツール]&gt; [挿入...、その後の間に1ピクセルのスペースを残して、別の上に各サブスタック1を挿入します。 </li><li> [イメージ]タブで、[スタック]を選択&gt; [モンタージュを作る...開始とキャプチャオートファゴソーム形成のイベントの最初と最後のフレームに仕上げモンタージュを作成します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

このプロトコルに記載されている方法は、オートファゴソーム形成の間にタンパク質の局在を可視化することができます。我々は、ポイントスキャン共焦点、スピニングディスクを共焦点と全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査を含む説明イベントを可視化する様々な方法を試してみました。我々は、一般的な目的のために標準の広視野落射蛍光は感度と分解能との間の最良の妥協を提供することを...

自食作用は1-3オートファゴ形成の最終的な結果のために多数のタンパク質の調整を必要とする非常に動的なプロセスである。顕微鏡は、おそらく最も一般的にオートファジー4を研究するための適用手法です。最もファジータンパク質の局在化は、広く両方の内因性タンパク質を免疫染色することによって及び蛍光標識外因性タンパク質の発現により、固定細胞において研究されている。また、電子顕微鏡（EM）、単独および免疫金標識との組み合わせでは、これらの構造5,6の細部を説明した。時間-これらの技術は空間の3次元のオートファゴソーム形成の我々の理解を確立しているという事実にもかかわらず、彼らは4 番目の次元の情報の十分な量を提供するために失敗している。それはpossiとして近くにオートファゴソームの形成に続くことができるようにライブセルイメージングは​​この障壁を克服リアルタイム7〜BLE。この技術は、第吉森ら8によってファジーを研究するために用いられ、今後ますます使用されている。 タイムラプス顕微鏡は、生きた細胞内で、一定期間にわたってPOIの局在をキャプチャします。よく特徴付け自食作用および/または細胞小器官マーカーでこの情報を比較することにより、生細胞画像解析は、オートファゴ形成の大きな空間的および時間的文脈でPOIを置くことができる。固定された細胞のイメージングは​​、単一のキャプチャに基づいていながら、ライブセルイメージング解析は、オートファゴソーム形成のすべてのステップに沿ってPOI定位の繰り返し取り込みに基づいています。固定した細胞のイメージングが同時にlifecyの様々な段階で撮影多くのオートファゴソームにその平均ローカライズに基づいて、POIの役割のみを引き受けることができつつ、ライブセルイメージングは​​、オートファゴソーム形成の具体的なステップでPOIの貢献を証明することができますCLE。 ライブセルイメージングは​​、高パワーの分析方法であるが、考慮しなければならないいくつかの固有の限界を有している。まず、生細胞のイメージングは​​、1つ以上の外因性の蛍光標識タンパク質の発現を必要とする。蛍光タグのサイズは大きくなる傾向があり、彼らは、時には立体的理由のためにタンパク質の挙動を変更することができます。それらは膜の2次元の限られた空間で機能する必要があるとして、この状況は、膜タンパク質に対して強調されている。注目すべきは、オートファゴは膜構造であり、従ってそれらの形成は、膜結合タンパク質を大量に必要とする。 問題の別のセットは、POIの発現レベルに接続されている。原理的には、外因性タンパク質は、内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現されるべきである。これは、そのサブ細胞内局在の重要な調節因子が飽和されないことを保証し、目電子分析は生物学的に関連するようになります。それらは、内因性レベル以上表される場合、それらはファジー応答9を阻害する傾向があるので、さらに、ファジータンパク質の過剰発現は、避けるべきである。 POIの発現レベルは、光退色なしに時間の良い期間の後に、そのローカライゼーションを可能にするのに十分高くなければならないので、逆に、妥協点に到達しなければならない。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の最適な発現レベルを達成するには、微調整の多くを必要とするが、それは安定してPOIのさまざまなレベルを発現する細胞株を確立し、スクリーニングすることによって実現可能である。 標準的な蛍光顕微鏡を用いて達成することができる空間分解能は別の制限要因である。解像度はいくつかの理由のために制限することができるが、最高の状態で、横方向の分解能は250nmで前後になる。これは、これより小さい距離で区切られているオブジェクトが接続されている（または単一として表示されることを意味します250 nmのは、彼らが実際にあるより大きな画像で表現されますよりも小さな物体）とオブジェクト。したがって、画像は常に念頭に置いてこれを解釈されるべきで、そのようなEMなどの補完的な技術は細かい超構造の細部を解決する必要があります。 最後に、生細胞画像化は、本質的に長期間にわたって潜在的に、光に露出させるセルを必要とする。これは、セル、光毒性として知られる現象の生理学的応答を変化させることができる。 我々は正常にオートファゴソームがERストランド10,11と密接に関連しているPI3P豊富なリング状の構造と呼ばomegasomes、由来することを初めて記述するPI3P結合タンパク質DFCP1のライブセルイメージングを使用している。我々は明らかにLC3陽性構造はomegasomesと密接に関連して形成し始めることが示されている。ここ細胞株を用いた生細胞に対して安定GFP-DFCP1を発現することを示唆している目的のタンパク質のイメージングは​​、オートファゴソーム形成におけるその役割の特性評価のための堅牢な空間および時間枠を確立します。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

自食作用は、特に栄養素の不足、アミノ酸の欠如によって引き起こされる細胞応答である。自食作用は細胞質、長寿命のタンパク質およびタンパク質凝集体であっても、欠陥のある細胞小器官、およびウイルスまたは細菌を隔離ファゴソームと呼ばれる二重膜構造の形成、によって定義される。オートファゴソームは、最終的に細胞質に戻ってリサイクルされる生産の栄養素と、そのコンテンツのバルク劣化につながるリソソームと融合。そのため、オートファジーは、細胞の恒常性のために重要であり、オートファジーの調節不全は、疾患、特に神経変性、老化やがんにつながることができます。 オートファゴソームの形成は、細胞がコアオートファジー機械と呼ばれる、タンパク質の特定のグループを割り当てているため、非常に手の込んだプロセスです。コアオートファジー機械は機能MEMBRANで例えば 、多様な細胞プロセスに関与する付加的なタンパク質によって補完されミトコンドリアとリソソーム生物学におけるe密売、。オートファゴソームの形成と分解のためのこれらのタンパク質の調整はオートファジーの非常にダイナミックで洗練された応答を構成している。ライブセルイメージングは​​1つが、単一のオートファゴソーム形成のイベントのレベルまで各オートファジー関連タンパク質の分子の寄与を下に従うことができ、リアルタイムで、そのためこの手法は、高い時間·空間分解能を提供しています。 ここでは、我々の分析のための空間的および時間的なコンテキストを確立するために、安定的にGFP-DFCP1を発現する細胞ラインを使用。オートファゴソームの形成につながる前駆構造ですDFCP1マークomegasomes、。目的のタンパク質（POI）は、赤やシアン蛍光タグのいずれかをマークすることができます。ミトコンドリアとリソソームERのような別の細胞小器官は、、、すべてのオートファゴソーム形成の異なるステップに関与しており、特定のトラッカーの染料を使用してマークすることができます。 AUTOPのタイムラプス顕微鏡この実験的なセットでhagyアップ、情報が四次元、 すなわち時間について抽出することができます。したがって、我々は時間と空間にオートファジーにPOIの寄与に従うことができます。

プロトコルは説明では、安定的にオートファジーを誘導する条件下では、GFPタグDFCP1を発現している細胞株におけるCFP-タグLC3の局在に従うことをタイムラプス顕微鏡を使用している。この実験の結果は、2シリーズまたはGFP-DFCP1とCFP-LC3に対応する画像、緑色から1と青のチャンネルから1つのスタックのキャプチャです。我々はさらに、プロトコルのセクションで説明したように、単一のオート...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K ビュー.  The Babraham Institute. 蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。

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Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

生物学

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...