ここでは、心臓とは別に心内膜細胞と冠状動脈細胞を単離するための詳細なプロトコルを紹介し、細胞型特異的な遺伝子発現と機能を理解するのに役立つ。この方法の主な利点は、単離されたEECおよびCECの高純度および生存率であり、細胞は単離時に生理学的特性を維持する。CECとEECsは多くの面で異なるので、これらの細胞集団を独立して調査する能力は、様々な心臓病における細胞型特異的メカニズムの探索を可能にする。
この方法は、細胞型特異的な方法で多数の心臓病を担う転写およびエピジェネティック因子の研究を容易にすることができる。この方法の最もトリッキーな部分は、異なる心臓部分を決定し、細胞型汚染を避けるために消化を正しくタイミングすることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究科学者であるYifei Miaoです。
6つの50グラムから100グラムのスプレイグ・ドーリーラットの心臓を収穫した後、50ミリリットルの冷たいHBSSで臓器を3回洗い、余分な血液を取り除き、1つの心臓を解剖顕微鏡の下に置きます。心臓を平坦な後面に置いて、組織の左右を識別し、肺動脈を見つける。はさみを使用して肺動脈を右心室まで切り裂き、頂点に達するまで中隔に沿って切断する。
肺動脈と右心室の接合部に達するまで、中隔に沿って心臓の後側の頂点から切断を続ける。この時点から、心臓の前側と後部の両方を前の解剖ポイントに垂直に切断し、右心室の自由壁が心臓の残りの部分から解放されるまで中隔から離れる。その後、右心室自由壁をDMEMの5ミリリットルチューブに配置し、大通りを再び見つけて、ちょうど実証したように左心室自由壁の収集を容易にします。
すべての心室のない壁が収集されたら、組織サンプルを60センチメートルの培養皿に移し、内面を皿の中で下に横たわらせます。1ミリリットルのピペットチップを使用して、組織の内面だけが浸るまで、組織片の直下の皿に0.5〜1ミリリットルの消化バッファーを加えます。望ましくない細胞汚染を避けるためには、心室の内面のみが消化バッファーに浸され、正確に5分間消化することが重要です。
培養インキュベーターで5分後、内皮細胞培地の5倍の体積で消化を停止する。その後、1ミリリットルのピペットを使用して、新鮮な媒体で各心室の内面を洗い流し、40マイクロメートルのストレーナーを通して流出を氷上の50ミリリットルのコレクションチューブに移します。冠状動脈内皮細胞消化の場合は、内層から汚染することなく左心室の外表面に沿って切断し、各チューブ断片を1ミリリットルの消化バッファーを含む別の5ミリリットルチューブに入れる。
EICからの汚染を避けるためには、心室の外面から切り取るだけすることが重要です。解剖はさみを使用して、心室の壁を小さな1立方ミリメートルにミンチし、チューブを37°Cのウォーターバスに15〜20分間置き、2〜3分ごとに渦を出します。細かい部分が小さいが目に見える場合は、チューブに内皮細胞培地の4ミリリットルを追加し、氷の上の50ミリリットルの収集チューブに40マイクロメートルストレーナーを介して溶液の全容を転送するために5ミリリットル血清ピペットを使用します。
消化後にCD31陽性細胞集団を単離するために、細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を吸引する。ペレットが赤色の場合、37°Cの水浴で5分間のインキュベーションのために、チューブあたり1〜2ミリリットルの赤血球ライシスバッファーで細胞を再懸濁する。インキュベーションの終わりに、PBSの10ミリリットルで溶精を停止し、第二の遠心分離で細胞を収集します。
次に、細胞の各チューブに90マイクロリットルの選別バッファーと10マイクロリットルの抗CD31 PE抗体を加えます。ボルテックス後、セルを摂氏4度で10分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、完全な混合でチューブに仕分けバッファーの10ミリリットルを追加し、遠心分離によって細胞を収集します。
ペレットをチューブあたり80マイクロリットルの選別バッファーに再懸濁し、続いて20マイクロリットルの抗PEマイクロビーズを添加する。ボルテックス後、チューブを摂氏4度で15分間置き、続いて10ミリリットルの分別バッファーを遠心分離で洗浄します。氷上の選別バッファーの500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、磁気セパレータに超常磁球を含むカラムを配置します。
3ミリリットルの仕分けバッファーでカラムをすすいでください。カラムが空になったら、500マイクロリットルの心内皮細胞懸濁液をカラムに加え、続いて4回の洗浄を行い、1回の洗浄ごとに3ミリリットルの仕分けバッファーを使用します。最後の洗浄後、カラムを新しい15ミリリットルの回収チューブに移し、カラムプランジャーと新鮮な内皮細胞培地5ミリリットルを使用して、CD31陽性細胞をカラムから回収管に洗い流します。
次いで、分離して分離されたビーズ内皮細胞を遠心分離によって採取する。予測通り、定量PCRは、ベータアクチンに対して、心内皮細胞が冠状動脈内皮細胞と比較して、より高いレベルの内心マーカーNpr3、Hapln1、およびCdn11を発現することを明らかにした。同様に、冠状動脈内皮細胞は、内膜内皮細胞と比較して、より高いレベルの冠状マーカーFabp4、Mgll、およびCd36を発現した。
さらに、両タイプの細胞は、冠状動脈内皮細胞においてわずかに高いレベルで汎内皮細胞マーカー遺伝子Cdh5を発現した。細胞集団に特異的なFACSや抗体を用いて、細胞をさらに浄化することができます。たとえば、アンチ Npr3 を使用して EECs を並べ替えたり、アンチ Cd36 を使用して CECs を並べ替えたりすることができます。
この技術は、研究者が細胞型特異的な方法で心臓の発達と疾患におけるEECとCECの役割を探求する道を開いた。
