我々の酵素法は、制御された数の重合度を有するプロテインオリゴマーを使用する。これは、タンパク質ベースの材料構築と同様、単一分子力分光分析研究のための完璧なサンプル調製物です。我々の方法は、標的タンパク質にシステインを導入しない。
システインはタンパク質にとって最も重要な機能残基の1つであるため、重合物質タンパク質または酵素の構築を容易にします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるイビン・デンとシェンチャオ・シーです。まず、20グラムのクロム酸カリウムを40ミリリットルの超純水にビーカーで溶かします。
ジクロメートカリウム溶液に360ミリリットルの濃硫酸をゆっくりと加え、ガラス棒を使って軽くかき混ぜます。クロム酸にガラスカバースリップを入れ、摂氏80度でオーブンに30分間移します。カバースリップを水で洗浄し、絶対エチルアルコールを洗浄し、カバースリップを窒素の流れで乾燥させます。
光から保護しながら、室温で1時間、容量APTESトルエン溶液によって1%体積でカバースリップを完全に浸漬。最初にトルエンでカバースリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、カバースリップを窒素の流れで乾かします。カバースリップを摂氏80度で15分間インキュベートし、室温まで冷まします。
ピペットを使用して、2つの固定されたカバーリップの間のDMSO溶液中の1ミリグラム当たり1ミリグラムの200マイクロリットルをDMSO溶液に加え、光から保護された1時間インキュベートします。1時間後、最初にDMSOでカバーリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、残留スルフォ-SMCCを除去します。カバースリップを窒素の流れの下で乾かします。
ピペット60マイクロモルGL-ELP-50 cys-タンパク質溶液を機能化したカバースリップに入れ、摂氏25度で約3時間インキュベートします。その後、カバースリップを超純水で洗い、未反応のGL-ELP-50-cysを取り除きます。官能化されたカンチレバー表面を調製するには、まず片持ち面をクロム酸に浸し、80°Cで10分間片持ち面を洗浄します。
酸を洗い流すために水と絶対エチルアルコールを使用してください。プラスチックチューブキャップに1時間アミノ酸分を行うほど、容量APTESトルエン溶液で1%体積でカンチレバーを浸します。絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすぎ、80°Cで15分間焼きます。
片持ち体をスルフォ-SMCC溶液に1時間浸し、絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすきます。cys-ELP-50-NGLを表面にリンクするには、カチレバーをcys-ELP-50-NGLにスルフォ-SMCCのマレイミド群に1.5時間浸漬します。その後、未反応のcys-ELP-50-NGLを超純水で片持ち体に洗い流します。
次に、機能性のある片持ち体を、200ナノモルOaAEP1を用いた50マイクロモルGL-CBM-XDockerinタンパク質溶液200マイクロリットルを含む溶液に浸漬し、20〜30分間摂氏25度に置きます。その後、AFMバッファーを使用して未反応のタンパク質を洗い流します。AFM実験の前に未反応の残留タンパク質を洗い流すのが重要です。
対象となるグリゲーション単位の凝集-T-L-タンパク質をカバースリップ表面に固定化されたGL-ELP-50にリンクするには、15マイクロリットルのOaAEP1をカバースリップに加え、30分間インキュベートさせます。未反応のタンパク質を洗い流すために15〜20ミリリットルのAFMバッファーを使用してください。TEVプロテアーゼを100マイクロリットル加え、TEV認識部位でタンパク質ユニットを摂氏25度で1時間切断します。
その後、AFMバッファーの15〜20ミリリットルを使用して、残留タンパク質を洗い流します。OaAEP1によって30分間、目的の結合単位の凝集-T-L-タンパク質をGL-ユビキチン-NGLガラスにリンクします。ガラス表面に構築されるGL-ユビキチン-NGLを構築するタンパク質に応じて、ポリタンパク質調製ステップn1回を繰り返す。
最後のTEV切断反応を省略し、タンパク質ポリマー上の凝集を凝集-TEV-L-ユビキチン-n-NGLガラスとして凝集して予備する。10ミリモルの塩化カルシウムと5ミリモルアスコルビン酸を含むAFMバッファーを1ミリリットルをAFM液室に加えます。実験用に、機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。
プローブを AFM バッファに浸します。表面から毎秒400ナノメートルの一定の速度で片持ち面を引き込みます。その間に、4,000ヘルツのサンプルレートで力延長曲線を記録します。
等分割定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数K値でAFMバッファ内の片持ち体を較正する。ドッカリンで機能したカンチレバーチップを、凝集して機能するタンパク質に取り付け、凝集ドキンペアを形成します。次に、JPKデータ処理ソフトを開き、特徴的なのこぎりのようなパターンと高い剥離力を持つ力延長曲線を選択します。
本研究では、OaAEP1ライゲーションにより隣接タンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力およびコントラ長インクリメントとして発現されるポリマーにおけるタンパク質単量体安定性に影響を及ぼさなかったが、以前の研究と同等であった。フェルベドキシンのフェリック形態の精製は、495ナノメートルおよび575ナノメートルの典型的なUV視覚化吸収ピークを提示したが、亜鉛形態は、ステップワイズ消化およびライゲーションのSDSページゲル結果は、TEV切断、純粋なGFP-TEV-プロテアーゼ、および精製された製品-UBQuitiのタンパク質混合物である凝集性TEV-L-ユビキチンを示した。
切断されたGL-ユビキチンおよび凝集-TEV-L-ユビキチンライゲーション混合物を、OaAEP1および純粋OaAEP1の有無にかかわらず同様に示す。ペプチドの取り付けに成功するためには、活性スルフォ-SMCCで表面を機能化することが重要です。ここでは、重合タンパク質を構築する新しい方法を提供します。
これは、研究者が単一分子力分光法を使用して複雑なタンパク質システムを研究することを容易にします。クロム酸は強く腐食性および酸性である。準備して取り扱うときは注意してください。
