Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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TB와 HG 유럽 연구 위원회 "Cellufuel, 고급 보조금 번호 294438"를 통해 재정 지원을 인정 한다. SS 금융 인정 HCS 인정 교육 및 Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt)를 통해 연구에 대 한 연방 정부에서 재정 지원, 과학 교육에 대 한 바이에른 주 교육부에서 지원 통해 연구 초점 "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-캔터". 우리는 기술 지원에 대 한 코니 Hasselberg-크리스토프와 마르티나 Hörig 감사

저자는 공개 없다.

AFM의 도입 기반을 SMF, 그것을 직접 내 고 intermolecular 개별 단백질, 핵 산 및 다른 생체3,,45의 널리 사용된 기법으로 진화. 성공적인 SMF 실험에 대 한 전략을 결합 하는 적절 한 표면 필수입니다. 천연 및 합성 폴리머에 intramolecular 힘을, 중합체는 기판 표면 및 AFM 팁36,,3839,40,41직접 결합 될 수 있습니다. 그러나 분자 채권 등 간 분자 상호 작용의 수사를 위해, 그것입니다 이종 bifunctional 못 링커 등 polypeptide 사슬, 유연한 링커 분자 AFM 팁을 상호 파트너를 연결 하 고 수 있도록 바인딩 파트너의 올바른 방향에 대 한 단거리 표면 힘을 극복 하 고 변성 그리고 단백질21,,2223의 전개를 피하기 위해 기판 표면 24,25,26,,2742. 우리 따라서 이종 bifunctional 못 스페이서를 사용 하 여 그들의 접근 주 아민 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 대 한 간단 하 고 곧장 앞으로 프로토콜을 설명 합니다.
우리가 그것의 적용을 보여주는 상호 작용의 수사 adhesin 미 균 에서 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn, 사이 힘 최근에 자세히 설명 다른 곳13.
표면 화학 잘 설립 하 고 분석 하 고 유사한 접근 여러 SMF 실험19,,4243,44,45에서 성공적으로 사용 되었습니다. 표면에 폴리머 실 란 커플링 사용 하는 silylether는 가수분해. 가수분해의 정도 silanization 과정에서 통제 될 수 있다 형성된 된 실록 산 결합의 금액에 따라 달라 집니다. 높은 상호 작용 힘 (≥ 1000 pN)는 SMF 측정 하는 동안 예상 하는 경우는 silanization 수행 통해 -기상 증 착30 낮아집니다의 지속적인 층의 형성 귀착되는 해야 합니다. 많은 실험 (예를 들어, 많은 단백질-단백질 상호 작용), 상호 작용 힘 몇 백 pN 및 설명된 절차는 실록 형성 수성 단계에서 증 착에 의해 실시 및 언바운드의 범위에는 유기 실 에탄올 (단계 1.1.7) 열 (단계 1.1.8) 치료 다음 씻어 신중 하 게, 충분 하다.
또 다른 중요 한 단계 나머지 EDC를 세척 하 고 보 건국 분자 표면 (1.2.3 단계)에서 남은 단백질에 carboxyl 그룹의 활성화로 이어질 것입니다. 이 기능을 변경할 수 있습니다 동일한 표면에 단백질의 가교에서 어느 결과 또는 몇 반대 표면에 다른 단백질에 단백질을 활성화 하는 covalently. 이 단백질 표면 사이의 도메인 전개 동반 가능성이 높은 파열 힘 귀착되는 AFM 팁의 클램핑 이어질 수 있습니다 ( 그림 3b, 추적 1, 4 및 5 참조 Fn 도메인의 전개)46. 못 스페이서의 활성 NHS 에스테 르는 불포화 경우 같은 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서, Tris 버퍼 식 염 수를 가진 외피는 좋습니다 (단계 1.2.6), 트리 스의 1 차 아민 냉각 나머지 아미노 반응 그룹으로.
Silanized 유리에 Fn의 균일 분포를 리드 stepwise 프로토콜에 따라 표면 ( 그림 2참조), 단백질의 dimeric 형태를 떠나. 이 솔루션에서 Fn´s 구조를 닮 고 다른 샘플 표면37에 이전 AFM 데이터와 일치. 또한, AFM 팁에 RrgA의 적절 한 농도, 얻어진 다는 SMF 측정 (그림 3 및 그림 4) 동안 잘 정의 된 상호 작용 이벤트 ~ 20%의 대상 값을 생성. 또 다른 우아한 방법은 다양 한 단백질 농도 및 부 화 번 외 샘플 기판 및 캔틸레버 끝에 결합 하는 분자의 양을 제어 실-대리인 다른 보조 기능 그룹의 조합입니다. 못-폴리머에서 연장 하는 단백질 반응 그룹의 비율을 변경 하 여 고정된 단백질의 수는 제어15,16,,1718수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜 또한 다른-NH2 포함 된 분자를 무력화 하거나 유리 및 실리콘 질 화물 외 다른 실리콘 산화물 표면에 몇 단백질 조정 사용할 수 있습니다. 단백질 디자인 따라 아민 반응 carboxyl 그룹으로 변경할 수 있습니다 통해 단백질 하 sulfhydryl 반응 그룹 (예를 들어, maleimide 또는 pyridyl 직교 이황화) 무료-SH 그룹. Fn,이 미리 정의 된 방향13,,1720결과.
요약 하자면,이 프로토콜 다른 요구 사항을 제공 하기 위해 조정 될 수 있다 고 단일 분자 힘 분광학 실험 외 다른 생물 응용 프로그램에 적합 합니다.

광학 및 자기 핀셋, 옆에 원자 힘 현미경 (AFM)1,2 유용한 도구를 분석 하 고 분자 조작으로 떠오르고 있다 및 그들의 속성 및 기능, 외부 힘3에 그들의 응답을 포함 하 여 조사 ,4. 반면 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 방법, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 석 영 크리스탈 중량 (QCM) 설정, AFM 수 단일 분자 (SMF)5 및 단일 셀 수준 (SCFS)6에 상호 작용을 측정 하 . 이러한 기술은 나왔고 캐치 채권 S. 구 균에서에서 Fn 바인딩 단백질에 의해 형성 된 대장균 pilus 단백질만 노 오 스7, 또는 협동 β-지퍼 FimH 반복의 상호 작용에 대 한 발견 처럼 바인딩 메커니즘에 대 한 값진 통찰력 바인딩 Fn8시. 최근 pilus-1 adhesin RrgA9,10 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)11 에서 fibronectin12 에 바인딩할 수는 보여줄 수 있었습니다. 와 그것의 2 개의 터미널 도메인. 이 새로운 2-도메인 바인딩 메커니즘을 탠덤 β-지퍼에서 다른 고 수 있습니다 형성 하 고 유지 과도 fibronectin 포함 된 연락처 호스트 표면13piliated pneumococci는 밝혔다.
SMF 실험의 성공을 비판적으로 고체 표면 및 AFM 팁에 생체의 기능 및 기본 동원 정지에 따라 달라 집니다. 높은 힘 SMF 측정 하는 동안 발생할 수 있습니다, 단백질 해야 선호 covalently 결합 표면에. 많은 단백질 등의 생체는 물론 (무기) 고체 표면, 나노 입자와 문학14,15에서에서 설명 하는 다른 장치에 전체 셀의 동원 정지에 대 한 다른 연결 방법 ,16,17,18,19,20,,2122,23,24, 25,,2627. 이러한 프로토콜은 자주 확인 유해 물질의 사용, 수행 및 특수 장비 (예를 들어, 플라즈마 클리너)를 필요로 하기 어렵습니다. 한쪽에 silane 반응 그룹 및 그들의 다른 쪽에는 아민 반응 그룹 heterobifunctional crosslinkers의 두꺼운 폴리머 레이어를 연결할 몇 분자 유리를 하는 간단한 방법이입니다. 어플리케이션, 커플링 에이전트 가변 길이, 예의 유연한 하이드로-탄소 사슬을 함유 할 수 있다., polyethylenglycol (나무 못). 그들은 수정 된 표면 (예를 들어, 소수 성, 정전기 그리고 van der Waals 상호 작용)의 일반적인 상호 작용을 억제 하 고 결합 된 분자 회전 자유를 제공할 수 있습니다.
여기, 우리는 공유 결합을 포함 하는 하나 이상의 무료 아미노 그룹 단백질의 일반적인 프로토콜 설명 (-NH2) 유리를 표면 및 실리콘 나이트 라 이드 AFM 팁 통해 는 heterobifunctional ethoxy silane 못 carboxyl (-COOH). 이 프로토콜은 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn의 상호 작용에 따라 궁 행 하는 SMF 실험, 사용할 수 있습니다 (에 대 한 개요 그림 1 참조).
첫 번째 단계는 표면28,29,,3031의 silanization 이다. 그것은 반응성이 매우 높은 SiOH 그룹을 형성 하기 위하여 커플링 에이전트의 ethoxy 그룹의 가수분해를 포함. 이 기판에 SiOH 그룹으로 반응 수 있습니다. 기본 응축에, 이러한 silanols 양식 수소 결합을 기판에 확산 있습니다. (요구 하는 일반적으로 열 또는 물을 제거 하는 진공) 보조 응축 반응, 실록 산 결합 형성 된다. Covalently 연결 된 유기 실 란 계층 결과.
두 번째 단계는 단백질 기능을 결합 (-COOH) 폴리머32에서 확장 하는 그룹. 첫째, 산 성은 반응 N-hydroxysuccinimid (NHS) 에스테 르 중간, 기초가 튼튼한 보 건국/EDC를 통해 얻은 변환 됩니다 (1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 화학33 및 대체를 겪 습 및 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 한다.
이 방법에서는, 실리콘 질 화물 AFM 팁 및 무작위 방향에서 유리 기판에 인간의 Fn RrgA 결합 했다 그리고 그들의 상호 작용 힘 단일 분자 수준에서 분석 했다. 우리의 결과 설명된 표면 화학은 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 측정 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여 줍니다. 이 화학 일반적인 배경 상호 작용을 감소, 데이터 수집 기간 동안 작은 변경 적용 이며 따라서 무척 정확한 SMF 실험에 적합.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; analytical purity</td></tr><tr><td>Doubly distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&amp;ge; 99.8 %; analytical purity</td></tr><tr><td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H5)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; for synthesis</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Probe molecule &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Fibronectin, human plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; RrgA</td><td></td><td></td><td>Produced in laboratory</td></tr><tr><td>Sodiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&amp;ge; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass cutter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Inert gas desiccator</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory oven</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Brand</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l, 100-1000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>Spring constant &amp;le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Sonication bath</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech science precision wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&amp;nbsp;nm</td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing paper</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

최근 몇 년 동안, 원자 힘 현미경 (AFM) 단일 분자 힘 분광학 (SMF) 분자 속성 및 기능에 대 한 우리의 이해를 확장을 기반으로. 그것은 우리에 게 자세히 호스트 표면 수용 체에 어떻게 세균 adhesins 바인딩 생물 메커니즘, 예를 들면의 다양성을 탐구 하는 기회를 주었다. 다른 요인 들 중 고체 표면 및 AFM 팁에 대 한 관심의 생체의 기능 및 기본 immobilization SMF 실험의 성공에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 순서로 silane-말뚝-carboxyls와 잘 설립 N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 화학을 사용 하 여 실리콘 표면에 단백질의 공유 결합에 대 한 간단한 프로토콜 설명 에 세포 외 기질 단백질 fibronectin (Fn)와 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)에서 pilus-1 adhesin RrgA의 상호 작용을 찾아보기. 우리의 결과 표면 기능화 리드 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 AFM 캔틸레버 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여합니다 측정 계시 RrgA 52 pN의 평균 힘 Fn에 바인딩합니다. 프로토콜 몇 사이트를 통해 특정 무료 thiol 그룹을 조정할 수 있습니다. 이 미리 정의 된 단백질 또는 분자 방향 귀착되 고 SMF 외 다른 생물 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다.

프로토콜 설명 여기 를 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 결과 임의의 방향 (그림 1) 액세스할 수 있는 그들의 1 차 아민. 그림 2 (왼쪽)와 silanized 유리 표면의 AFM 이미지를 보여줍니다 그리고 질소의 부드러운 스트림 아래 샘플의 탈수 후 (오른쪽) Fn 움직일 수 없이 기록. Silane 폴리머 레이어 Fn와 기능성된 표면에만 작은 표면 파형 높이 약 2-5 nm (그림 2, 오른쪽), 동안, 약 10 nm 높은 Fn 분자는 명백한 (그림 2, 왼쪽). 클로즈업, Fn의 dimeric 구조를 인식할 수 있습니다. Fn 분자 말뚝 표면 코팅 위에 4-5 nm의 높이와 길이의 소형 것 같다 ~ 120 nm (삽입 참조).
조사는 최근 자세히 설명 우리의 그룹13, Fn와 RrgA의 상호 작용 힘에 RrgA 실리콘 질 화물 AFM 팁과 유리 기판 (그림 3a)에 인간의 Fn에 결합 했다. 그림 3 샘플 분리 곡선 Fn 1 µ m s-1의 당기 속도에서 기록 된 RrgA의 상호 작용의 대표적인 팁을 보여 줍니다. 사용 된 표면 화학 상호 작용을 낮은 배경 및 체인 (eWLC) 모델 (빨간 곡선) 같은 확장 가능한 벌레를 사용 하 여 장착 했다 (그림 3a), 잘 모양된 (또는 2) 상호 작용 이벤트에. AFM 팁과 기판, 스트레칭 못 링커 (> 70 nm), 일반적인 표면 상호 작용까지 극복 후 보여줍니다 적합 (파열 힘 및-길이 그림 4참조)의 결과 플롯 ~ 19% 힘 곡선의 파열을 보여주었다 말은 파열 된 이벤트 RrgA-Fn의 상호 작용에 대 한 강제 ~ 약 100의 팁-샘플 거리에서 52 pN nm. 반면, 부적당 한 표면 화학 (여기, 염 분 그림 3b버퍼링 트리 스와 냉각 하는 생략) 여러 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 난다 상호 작용으로 인해 단일 상호 작용 이벤트에 대 한 명확한 평가 방해 것 이다 / 샘플 표면 및 AFM 캔틸레버 끝 사이의 단백질의 카 하 플 공유 링 높은 파열 힘 (추적 1) 단백질 (Fn) 도메인 (추적 4와 5)의 전개와 함께 가능 하 게이 리드.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> 그림 1: 표면 화학을 통해 개요. Ethoxy silane-말뚝-carboxyl의 가수분해 실록 crosslinks의 형성과 수산화 유리 표면에서의 결로 옵니다. Carboxyl 그룹 EDC의 반응 반응 o-acylisourea, 수성 해결책 (가수분해) 매우 짧은 반감기를 가진 아민 반응 중간 결과. 중간을 겪 습 및 대체 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 하는 NHS 에스테 르의 형성에 의해 안정 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> 그림 2: 동원 정지의 한 유리 기판 통해 heterobifunctional ethoxy silane 말뚝에 fibronectin carboxyl 커플링 에이전트. 기능성된 유리의 AFM 이미지 (왼쪽)와 표면 및 (오른쪽) 없이 Fn. 숫자 (삽입) 기판 표면에 균질 분산 개별 Fn 분자를 나타냅니다. 분자는 말뚝 위에 4-5 nm의 높이 dimeric이 고 컴팩트한 구조 채택 코팅과의 길이 > 100 nm. 이 솔루션에서 Fn의 구조를 닮 고 다른 표면, 예를 들어, 운 모에 이전 AFM 데이터와 일치 (눈금 막대의 상 = 500 nm)37. AFM 아래 이미지는 AFM 이미지에 표시 된 라인을 따라 높이 프로필. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> 그림 3: SMF 실험 및 대표 일러스트 힘 거리 곡선 RrgA-Fn 상호 작용의. (a) RrgA와 Fn covalently 연결을 통해 heterobifunctional ethoxy silane 못 했다 carboxyl 커플링 에이전트 실리콘 나이트 라 이드 AFM 외팔보 팁과 유리 표면, 각각. 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Fn와 상호 작용 수 축력 속도에 1 µ m s-1 의 RrgA와 Fn의 설명된 동원 정지에 대 한 얻은 표시 됩니다. 빨간 곡선 파열 힘 및 길이에 적용 된 확장 가능한 웜 같은 체인 맞는 나타냅니다. 그림은 Becke, 그 외 여러분, ACSnano 201813에서 수정 되었습니다. (b) 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Tris 버퍼와 냉각 없이 Fn 상호 작용에 대 한 얻은 염 분. 이 경우에, 트리 스의 1 차 아민은 결 석 활성 남아 있도록 NHS 에스테 르 남았다 불포화 실험 기간 동안. 이것은 다중 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 하며 단백질 표면 사이의 높은 파열을 초래한 AFM 팁의 클램핑 (Fn-) 함께 도메인 전개 (추적 1, 4, 5; 다른 비늘을 참고). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> 그림 4: 단일 RrgA-Fn 상호 작용의 힘 및 길이 분포. 힘 및 RrgA-Fn SMF 상호 작용 측정에서에서 얻은 해당 파열 길이 히스토그램 파열 (n = 1400) 1 µ m s-1의 상승 속도에. 히스토그램 공개 51.6 pN (가우스 적합, 검은 선)의 가능성이 가장 높은 파열 힘 fMP 와 축적의 파열 길이 약 100 nm. 그림은 Becke 외., ACSnano, 201813에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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Research

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Biochemistry

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

연구

생화학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

생체공학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

공학

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

화학

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

생물학

단백질 상호 작용의 Live Cell Single-Molecule Imaging-Based 정량화

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

저자 스포트라이트: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

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본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사