The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

注：準備、データ収集及びデータ解析ステップを含むプロセスフローの概要について、図2を参照してください。 1.試薬のセットアップ注：すべての化学物質は、取り扱いに注意しなければならないため、白衣、手袋と目の保護を使用する必要があります。すべての操作は、実験室フード内で実行する必要があります。具体的には、特別な手袋はクロロホルムを用いた場合に着用してください。 <ol><li>急速にそのような乾燥クロロホルムなどの低含水量で化学薬品を使用し、週間以上乾燥ではなく、保管してください。 APTES（（3-アミノプロピル）triethoxysilanが）およびPEG（ポリエチレングリコール）（ 表1参照）ため、-20℃で、窒素またはアルゴンガス下で両方の化学物質を保管吸湿性であり、PEGは、空気中で酸化を受ける。 </li><li>大気中の酸素や水分に株式の頻繁な露出を避けるために、理想的に窒素を用いてグローブボックスシステム内で、小さいアリコートを準備atmosphe再。 </li></ol> 2.機器のセットアップ注：可能な交差汚染を回避するために、ステップごとに新鮮できれいな容器を使用する。 <ol><li>きれいなガラス器具および60℃の超音波浴中で30分間、界面活性剤溶液中でピンセット。 </li><li>超純水で2回徹底的にステップ2.1から機器をすすぎ、超音波処理。 </li><li> RCA溶液中のステップ2.1からの熱機器（超純水、過酸化水素及びアンモニア（5：1：1））に75℃で45分間オーブン中でC、その後、超純水でそれらをすすぐ。 </li><li>最後に、乾燥窒素気流下、オーブン（100℃、3時間）でガラス製品、ピンセットを乾燥する。 </li></ol> 3.ヒント機能化 NOTE：ピンセット、船舶等は、ステンレス鋼、PTFE、ガラス、または該当する場合は、有機溶液中で化学的に安定である任意の他の材料から作られる。特に断りのない限り、Rにおける全てのステップを実行するT.必要なインキュベーション溶液の量は、カンチレバーチップの数に依存する。カンチレバーはすべての時点でそれぞれの溶液に浸漬されていることを確認します。 注：有機蒸気の吸入を避けるために、フードを使用してください。 <ol><li>カンチレバー表面上のOH基の形成（「活性化」）（約0.5時間）。 <ol><li>きれいなガラススライド上に、プラズマ室（100 W）に入れ、新鮮なカンチレバーチップ（10〜100 PN / NM：：SiNから、バネ定数材料）を配置するためにピンセットを使用してください。 </li><li>チャンバー（〜0.1ミリバール）を避難させる。 </li><li>酸素ガスとの洪水室と再び避難する。 </li><li> （20％、継続時間：15分、プロセス圧力：0.25ミリバールパワー）プラズマプロセスをアクティブにします。 </li></ol></li><li>カンチレバーのアミノシラン（約1時間）： <ol><li>プラズマプロセス中に、理想的には、これを行う- APTES溶液を2.5mlを調製し、ガラスシャーレ（ 表1参照）。 </li><li> Immediatelプラズマ処理後のYは、アセトン中で1秒間各カンチレバーを浸しAPTES溶液中で直後に配置します。 </li><li> RTで15分間インキュベートする。 </li><li>慎重に10ミリリットルのアセトンに一回10ミリリットルのクロロホルムに二回カンチレバーチップをすすぐ。 </li><li>任意の最終ステップ：清浄なガラススライド上に前工程からのプレースカンチレバーチップを70°Cで30分間、それらを焼く。表面活性化、 例えば、UV処理12のための代替戦略もあることに注意してください。 </li></ol></li><li> PEG化（約2時間）： 注：手順を実行し3.3.1-3.3.4アミノシラン中に。 NHSおよびマレイミド基は、水性環境中で加水分解を受けやすいとPEG自体は空気中で酸化の対象となります。そのため（特にステップ間で）タイミングは重要なパラメータである。詳細については13を参照してください。 <ol><li>クロロホルム溶液を（ 表1参照）を準備。 </li><li>結露を避けるために、、暖かいPEGは分量を開き、適切な量を計量する前に、室温まで粉末。 </li><li>アミノ基を有するポリマー又は脂質の結合のために、個別にそれらが完全に解決されるまで、それらをボルテックスすることにより、クロロホルム溶液中でNHS-PEG-NHS（6 kDa）のメチル-PEG-NHS（5kDaの）を解く。濃度については、表1を参照してください。 <ol><li>代わりに。チオール基を有するポリマーのカップリングのために別々にクロロホルム溶液中のMal-NHS-PEGとメチル-PEG-NHSを解決する。 </li></ol></li><li> NHS-またはマレイミドおよびメチル末端PEG分子（：500、典型的には1）との​​間に一定の数の比を調整するために必要に応じて溶液を混合する。理想的な比率は、準備、実験一連のサイクルで反復的に決定されなければならないことに留意されたい。 </li><li>クロロホルムの蒸発を防止するためにクロロホルム、飽和雰囲気中で1時間PEG溶液にカンチレバーチップをインキュベートする。 </li></ol></li><li>分子抱合を探る（&gt; 1時間）。 注：以下の3.4.1-3.4.3では、AFMチップの異なるプローブ分子の共有結合のための3つの例が記載されている。各分子のためのプロトコルを調整する必要がある。実施例1及び3-NHS化学で実施例2において、チオール官能化ポリマーPI- gが -PSがマレイミド化学を介してPEGに結合され、一方、使用されていることにも注意。詳細については、14を参照してください。 <ol><li>ポリ（アミノ酸）、ポリ-D-チロシン（40-100 kDa）のための<ol><li> 1MのNaOHでポリチロシン共役プローブ分子を溶解させる。 1 mg / mlの濃度に調整。 </li><li>官能化の直前にスピン脱塩カラム（7 kDaのMWCO）を用いてホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.1）のためのNaOHを交換</li><li>その後のホウ酸緩衝液5ミリリットルとエタノール5ml、最後にして、クロロホルム5mlで最初のカンチレバーをすすぐ。 </li><li>ポリチロシンホウ酸緩衝溶液中で1時間、カンチレバーチップをインキュベートした後、ホウ酸緩衝液ですすぎ超純水。測定まで超純水に保管してください。 </li></ol></li><li>線形バックボーン（ポリイソプレン、119 kDaの）を有するグラフトされた側鎖（ポリスチレン、88 kDa）の14を有するポリマーについては、 <ol><li>乾燥クロロホルムにPI-G -PSを溶かす。 4 mg / mlのへの接合溶液の濃度を調整します。 </li><li>クロロホルム5mlのカンチレバーをすすぎ、共役溶液中で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li>クロロホルム5mlに再度リンスし、クロロホルム飽和環境でクロロホルム中で測定まで保存し（クロロホルム蒸発を防ぐため）。 </li></ol></li><li>脂質POPEのために<ol><li>乾燥クロロホルムにPOPEに溶解する。 20 mMの濃度を調整します。 </li><li>脂質溶液中で1時間、カンチレバーのインキュベーション前に5mlのエタノールと超純水5mlを有するカンチレバーをすすぐ。 </li><li>インキュベーション後、5mlのクロロホルム、エタノ5mlでカンチレバーをすすぐlで（この順序で）暖かい、超純水5mlの未結合プローブ分子を除去し、クロロホルム残基を取り除くために。すぐに官能化されたヒントを参考にしてください。必要になるまで代わりに、クロロホルムに保管してください。 </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> 図1 NHS化学の例を用いて、先端官能化プロセスを示す（A）概略図。 （B）化学結合は、アミノ基を介して先端にプローブ分子を取り付けるために採用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4.表面の準備<ol><li>自己組織化単分子膜（SAM） 注：最初に、例えば表面が、自己組織化単分子膜を選択した。文献15を参照してください</s詳細については、&gt;まで。 <ol><li>それぞれ30分間超音波浴中の洗剤溶液および2回、超純水でクリーンなガラススライド。次に、追加の洗浄工程として、15分間、75℃で（ステップ2.3参照）RCA溶液中に置く。 </li><li>コー​​ト10nmのクロム、ニッケル、真空コーター中で100nmの金でスライド。そして、前に次のステップに直接RCA溶液中に再び冷蔵庫、清潔に保管してください。 </li><li> 12時間2 mMの1-ドデカン/エタノール溶液中に前の手順のスライドをインキュベートします。チオール基は金表面に結合した疎水性単層自己アセンブル。エタノール、超純水でスライドをすすぎ後、窒素ガスの流れによるドライ。 CCDカメラ10とゴニオメーターでの静的接触角測定と調製された表面の疎水性を確認する。 </li></ol></li><li>水素終端ダイヤモンド 注：第二の例のための表面としては、水素終端ダイヤモンドが選ばれました。以前に16記載のように表面処理を行った。 </li><li>サポートされている脂質二重層 注：最後の例では、表面支持された脂質二重層（SLB）を表面として使用した。そのような表面を得るために、リン脂質POPCからなる大型の単層小胞（LUVを）の溶液（0.1 mg / mlで）を押出法により形成した。その後、LUV溶液50μlを、新たに切断したマイカシート（A = 1 cm 2で）上に置き、30分間インキュベートした。最後に、この溶液を超純水20mlで洗浄した。のSLBの準備の詳細については、17,18を参照してください。 </li></ol> 5.データ集録注：実験では、液体中で測定する機能を提供し、AFMを使用します。データ収集およびデータ分析手順は関係なく使用AFMモデルの適用可能である。さらに、いくつかの実験ではtemperaturを制御する可能性を有することが有利である液体セル内の電子。カンチレバーの偏向は、レーザビームの偏向方法19を介して検出した。ばね定数は、熱雑音法20を用いて測定した。 <ol><li>体液中の測定に適しているAFMカンチレバーホルダーに官能化カンチレバーを挿入します。 </li><li> AFMにサンプリングされる（調製は上記参照）の表面を入れて、液体でそれをカバーしています。どちらも、カンチレバーと表面が今表面に向かって指しているカンチレバーの先端で液中に浸漬する必要があります。多くの場合、液体の滴が十分であることに注意してください。いずれの場合においても流体の蒸発は、閉じた流体セルを用いて、例えば 、避けるべきである。 </li><li>該当する場合、コントローラ上の所望の温度を調整します。 </li><li>システムは、少なくとも半時間平衡化しましょう​​。 </li><li>効果を減衰任意の表面を除外するために、遠く離れた表面からカンチレバーとカンチレバーの熱雑音スペクトルを記録します。通常1ことに注意してください0以上のスペクトルは、十分な信号対雑音比を得るために、蓄積されなければならない。 </li><li>表面アプローチ。先端形状と先端官能化を節約するためにアプローチプロセスは注意深く行わなければならないことに留意されたい。これは、間欠接触モードで接近、例えば、によって達成することができる。 </li><li> NM /ボルトで測定された逆の光てこ感度（InvOLS）を決定します。硬い表面に対してカンチレバー先端を押すことでこれを行います。 <ol><li>フォトダイオード電圧の変化対ピエゾ移動距離の傾きを測定することにより、InvOLSを決定します。カンチレバーの先端が表面に接触している力 - 距離曲線の一部にラインを取り付けます。脂質二重層のようなソフト面を含む実験では、脂質二重層（「欠陥スポット」）で覆われていない領域でこの手順を実行する。 </li></ol></li><li>熱雑音スペクトルに高調波発振器を適合させることによりバネ定数（PN / nm）を決定します。使用ばね定数決定のための自動化されたソフトウェア機能と、そうでなければ文献20を参照してください。 </li><li>実験を開始します。 <ol><li>各実験条件での数々の力 - 距離曲線を記録します。 1μmの距離を撤回、5 kHzの、1ミクロン/秒の先端速度のサンプリングレート：通常、実験パラメータに次の値を使用します。 注：場合によっては、検討した実験のダイナミクスに応じて、それは（「滞留時間」）の表面に接触して先端にある程度の時間を待機する必要があるかもしれない。 注：この実験特有のパラメータは、上記の値から大幅に逸脱することができます。 </li><li>長期の測定中に、フォトダイオードを再配置することによって随時フォトダイオード上のレーザ位置をゼロ。 </li><li>オプション：すべての力曲線の後、別のXY位置にAFMチップを再配置。 </li><li>実験の終了時に、感度およびスプリングを決定CONSTAシステムの一貫性および安定性を確認するために再度のnt。 注：実験前と後のばね定数と感度を比較することは、システムの特性およびチップの特性は実験の過程にわたって変化しないままであったことを確実にするための手段である。ばね定数の差が（&lt;= 15％）が大きすぎない場合には、バネ定数の決定の本質的な不確実性も15％程度であるので、それらは、平均することができる。大きな違いの場合は、最初に見つけると、さらなる実験を続行する前に、変化する見かけのばね定数の原因を排除することをお勧めします。 </li></ol></li></ol> 6.データ準備注：典型的には、ニュートンとナノメートル単位を変換するだけでなく、データが記載されている修正するための実験の特定のタイプとは無関係に行われ、このセクションの一般的データ準備工程において。実験特定のデータ分析はBRであるieflyそれぞれの代表的な実施例のセクションで以下にさらに説明する。 <ol><li>一般的に、すべてのデータの準備を行い、解析ソフトウェアIGOR Proを6に基づいて、 例えば家庭書き込まアルゴリズムによって自動的に繰り返す。 </li><li> InvOLS [NM / V]とばね定数[nNの/ nm]とでそれを掛けることによって発効[V]生の偏向信号（DEFL）を変換します。 </li><li>表面（アンロードカンチレバー）から十分な距離でカンチレバー上の力が0 NNのになるように力を相殺した。 </li><li> ：実際の先端位置（表面に対して測定した場合にも、分離と呼ばれる）を考慮にカンチレバーの曲げをとるのz *を計算する <img alt="式1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> のz * = 0は、表面のz位置に対応するように* zのオフセット。 注：ここで、Fは 、したがって、先端に作用する力であり、曲げ（ステップ6.2で決定された。）は、カンチレバーのs、zは測定されたz軸センサ位置（直接計器により与えられる）、kは （ステップ5.8で決定された）ばね定数を表している。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> サンプル調製、データ収集とデータ分析を示す図2.プロセスフロー図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

最後の数十年の間に、単一分子実験は分子メカニズムに前例のない洞察を提​​供し、生命科学とそれ以降で非常に貴重なアプローチであることが判明しました。 SMFS実験の良い有意義な統計値を達成するために、理想的には、同一の分子は、実験の全体​​にわたって使用されている。分子のアンサンブルを用いた実験とは対照的に、SMFS実験は稀な事象と隠された分子状態を検出すること?...

過去30年間に、原子間力顕微鏡（AFM）は、すべての3つの次元での分子の空間分解能を提供し、様々な溶媒中で動作させることができるので、生物学1,2および合成3の材料および表面を研究するための貴重なイメージング技術であることが判明している環境。加えて、AFM-単一分子力分光法（SMFS）はpNからμN政権に至るまで力を測定することが可能になり、4,5の折り畳みタンパク質に例えば前例のない洞察を与えている、高分子物理学6から8、および単一分子-表面相互作用9 -単一分子ではなく、分子のアンサンブルを研究の背後にある12 .theの根拠は、多くの場合、稀な事象や隠された分子状態をマスクする効果を平均化することを避けることである。さらに、このような等輪郭長、クーン長、接着自由エネルギー、などの分子パラメータの多数であることができる得。これは、以下の実施例に詳述されている。典型的なAFM-SMFS実験では、プローブ分子は、リンカー分子を介して非常に鋭い先端部に連結されている。チップ自体は曲げられる片持ち梁の端部に配置されている。先端が表面と接触した場合、プローブ分子は、この表面と相互作用する。表面から分子を分離するために、先端部の後退時にカンチレバーのたわみ、力、ひいては自由エネルギーを観察することによって決定することができる。意味のある統計値を得るために、いわゆる力 - 距離曲線の多数を取得しなければならない。さらに、真の単一分子実験（ すなわち 、1つを使用して、全実験期間にわたって同じプローブ分子）を有するプローブ分子は、AFMチップに共有結合されるべきである。ここで、共有結合を介して単一分子カンチレバーの官能化のための実験プロトコルが提示される。単一分子は、アミノまたはチオ介して結合することができるいずれかAFMチップのL群。コンジュゲーションプロセスは、使用されるポリマーの溶媒和特性を考慮して、溶剤（有機及び水性）広範な種類の中で行うことができる。 最初の部分では、共有結合的にAFMチップを、リンカー分子を介して単一分子（「プローブ分子」）を取り付けるための一般的なプロトコールが記載されている。この目的のために、有機NHS-またはマレイミド化学を13に使用される。 3つの例示的分子のためのプロトコルと共に、データ収集及びデータ解析プロセスが記載され、さらに読み出し用の参照が提供される。例分子である：（リニア）ポリマーチロシン、グラフトポリマーPI-G -PSおよび脂質POPE。これは共有結合システインを添付する例えば、プロトコルのわずかな変動が含まれています。また、セクションは、そのようなダイヤモンド表面、CH 3 -self組織化単分子膜と脂質二重層として異なる面の準備に専念しています。これらのインタフェースは、箴を持っているEN良い参照と例であることを。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td>
			<td>Hellma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry acetone (&#60; 50 ppm H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry chloroform (&#62; 99.9 %)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium tetraborate (&#62; 99.5 %)</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Biochrom, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofunctional &#945;-methoxy-&#969;-NHS PEG, 5kDa, &#8220;methyl-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;,&#969;-bis-NHS PEG, 6 kDa, &#8220;NHS-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heterobifunctional &#945;-maleimidohexanoic- &#969;-NHS PEG, 5 kDa, &#8220;Mal-PEG-NHS&#8221;</td>
			<td>Rapp, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule (polymer, lipid, etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 &#181;l) and glass lids</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven model UF30</td>
			<td>Memmert, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled sonicator</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma system &#34;Femto&#34;, 100 W</td>
			<td>Diener, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One separate glass syringe for each organic solvent</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR International GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes: 10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l and 100-1000 &#181;l</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater)</td>
			<td>Asylulm Research, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT)</td>
			<td>Bruker AXS, Santa Barbara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

原子間力分光法は、表面や界面での分子を研究する理想的なツールです。共有結合的にAFMチップ上に結合する単一分子の多種多様の実験プロトコルが提示される。同時に、AFMチップはAFMチップに結合した単一の分子を研究するための前提条件でチップと基板との間の非特異的相互作用を防止するために不動態化される。固体表面にバイオインターフェイス上の接着力、密着長さ、およびこれらの分子の自由エネルギーを決定するための分析がすぐに提示され、さらに読み出し用の外部参照が提供される。例分子は、ポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE（1-パルミトイル-2- oleoyl- のsn -glycero -3-ホスホエタノールアミン）である。これらの分子は、CH 3 -SAMsのような異なる表面、水素終端ダイヤモンドから脱着や各種溶剤条件下における脂質二重層をサポートされています。最後に、力分光法の利点は、単一分子実験は真に単一分子実験で研究されているかどうかを決定するための手段を含む、議論されている。

以下では、上記の結果は、例えば分子 ​​、すなわちポリマーのポリ（アミノ酸）、ポリチロシン、グラフトポリマーPI- グラム -PSおよびリンPOPE記載、提示されている。まず、各実施例について、データ収集及びデータ準備のための試し特定の詳細が提供される。その後、これらの分子は異なる表面から脱着された実験用の例示的な結果（CH 3 -SAMs、水素終端ダイヤモンドと脂...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.2K ビュー.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

1分子蛍光イメージングのためのコンパクトな量子ドット

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

工学

Scanning-probe Single-electron Capacitance Spectroscopy

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the electronic quantum structure of small systems - including individual atomic dopants in semiconductors. Here we present a capacitance-based method, known as Subsurface Charge Accumulation (SCA) imaging, which is capable of resolving single-electron charging while achieving sufficient spatial resolution to image individual atomic dopants. The use of a capacitance technique enables observation of subsurface features, such as dopants buried many nanometers beneath the surface of a semiconductor material1,2,3. In principle, this technique can be applied to any system to resolve electron motion below an insulating surface.
As in other electric-field-sensitive scanned-probe techniques4, the lateral spatial resolution of the measurement depends in part on the radius of curvature of the probe tip. Using tips with a small radius of curvature can enable spatial resolution of a few tens of nanometers. This fine spatial resolution allows investigations of small numbers (down to one) of subsurface dopants1,2. The charge resolution depends greatly on the sensitivity of the charge detection circuitry; using high electron mobility transistors (HEMT) in such circuits at cryogenic temperatures enables a sensitivity of approximately 0.01 electrons/Hz&frac12; at 0.3 K 5.

Scanning-probe single-electron capacitance spectroscopy facilitates the study of single-electron motion in localized subsurface regions. A sensitive charge-detection circuit is incorporated into a cryogenic scanning probe microscope to investigate small systems of dopant atoms beneath the surface of semiconductor samples.

走査プローブ単電子容量分光

The integration of low-temperature scanning-probe techniques and single-electron capacitance spectroscopy represents a powerful tool to study the ...

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

の単一波長シャドウイメージング<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emフォース予測など&gt;ロコモーション

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Making Record-efficiency SnS Solar Cells by Thermal Evaporation and Atomic Layer Deposition

Tin sulfide (SnS) is a candidate absorber material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. SnS offers easy phase control and rapid growth by congruent thermal evaporation, and it absorbs visible light strongly. However, for a long time the record power conversion efficiency of SnS solar cells remained below 2%. Recently we demonstrated new certified record efficiencies of 4.36% using SnS deposited by atomic layer deposition, and 3.88% using thermal evaporation. Here the fabrication procedure for these record solar cells is described, and the statistical distribution of the fabrication process is reported. The standard deviation of efficiency measured on a single substrate is typically over 0.5%. All steps including substrate selection and cleaning, Mo sputtering for the rear contact (cathode), SnS deposition, annealing, surface passivation, Zn(O,S) buffer layer selection and deposition, transparent conductor (anode) deposition, and metallization are described. On each substrate we fabricate 11 individual devices, each with active area 0.25 cm2. Further, a system for high throughput measurements of current-voltage curves under simulated solar light, and external quantum efficiency measurement with variable light bias is described. With this system we are able to measure full data sets on all 11 devices in an automated manner and in minimal time. These results illustrate the value of studying large sample sets, rather than focusing narrowly on the highest performing devices. Large data sets help us to distinguish and remedy individual loss mechanisms affecting our devices.

Tin sulfide (SnS) is a candidate material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. Here, we demonstrate the fabrication procedure of the SnS solar cells employing atomic layer deposition, which yields 4.36% certified power conversion efficiency, and thermal evaporation which yields 3.88%.

熱蒸着および原子層堆積法によって記録し、効率のSnS太陽電池を作ります

Tin sulfide (SnS) is a candidate absorber material for Earth-abundant, non-toxic solar cells. SnS offers easy phase control and rapid growth by congruent ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Quantitative Analysis of Vacuum Induction Melting by Laser-induced Breakdown Spectroscopy

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves several steps, include drawing samples, cooling, cutting, transport to the laboratory, and analysis. The whole analysis process requires more than 30 minutes, which hinders on-line process control. Laser-induced breakdown spectroscopy is an excellent on-line analysis method that can satisfy the requirements of vacuum induction melting because it is fast and noncontact and does not require sample preparation. The experimental facility uses a lamp-pumped Q-switched laser to ablate melted liquid steel with an output energy of 80 mJ, a frequency of 5 Hz, a FWHM pulse width of 20 ns, and a working wavelength of 1,064 nm. A multi-channel linear charge coupled device (CCD) spectrometer is used to measure the emission spectrum in real time, with a spectral range from 190 to 600 nm and a resolution of 0.06 nm at a wavelength of 200 nm. The protocol includes several steps: standard alloy sample preparation and an ingredient test, smelting of standard samples and determination of the laser breakdown spectrum, and construction of the elements concentration quantitative analysis curve of each element. To realize the concentration analysis of unknown samples, the spectrum of a sample also needs to be measured and disposed with the same process. The composition of all main elements in the melted alloy can be quantitatively analyzed with an internal standard method. The calibration curve shows that the limit of detection of most metal elements ranges from 20-250 ppm. The concentration of elements, such as Ti, Mo, Nb, V, and Cu, can be lower than 100 ppm, and the concentrations of Cr, Al, Co, Fe, Mn, C, and Si range from 100-200 ppm. The R2 of some calibration curves can exceed 0.94.

During vacuum induction melting, laser-induced breakdown spectroscopy is used to perform real-time quantitative analysis of the main-ingredient elements of a molten alloy.

レーザー誘起分解分光法による真空誘導融解の定量分析

Vacuum induction melting is a popular method for refining high purity metal and alloys. Traditionally, standard process control in metallurgy involves ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

金ナノ粒子に埋め込まれた膜フィルターを用いた放射性ヨウ素アニオン選択性淡水化の効率的な方法

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

原子間力顕微鏡カンチレバーを用いたナノインデンテーション:空気および流体中のナノスケールでの機械的特性測定

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

AFMSの並列アクティブカンチレバーアレイにより、ハイスループット検査が可能

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

著者スポットライト:Quattro-Parallel Cantilever Arraysを用いたアクティブプローブ原子間力顕微鏡の紹介

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

クワトロパラレルカンチレバーアレイを用いたアクティブプローブ原子間力顕微鏡によるハイスループット大規模サンプル検査(英語)

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...

Methods Article

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査