この方法は、従来の蛍光標識およびフローサイトメトリー分析手順に代わるものを提供し、これは時間がかかり、コストがかかり、サンプルの細胞機能を変化させるリスクを生じさせる。この技術の主な利点は、三次元屈折率断層撮影と機械学習は、迅速かつ正確なリンパ球同定を可能にするラベルフリーかつ定量的な方法である。この技術の意味は、リンパ球の同定が疾患診断および適切な治療アプリケーションにとって極めて重要であり得るため、血液癌および自己免疫疾患の治療に及ぶ。
この方法はリンパ球集団に関する洞察を提供することができるが、細菌を含む他の目的の単一細胞の分析にも適用することができる。3D定量位相イメージング技術の視覚的実証は、技術の実行方法の明確な指示を容易にし、その応用に関する洞察を提供することができるため、非常に重要です。蛍光活性化細胞選別により、各リンパ球サブセットを採取することから始めます。
最適なイメージングのために、各細胞サンプルをRPMI培地のマイクロリットル当たり180細胞の濃度に希釈し、最初の希釈サンプルの120マイクロリットルをイメージングチャンバーにゆっくりと注入する。チャンバー内の気泡の不足を確認した後、蒸留水を3D定量位相顕微鏡の対物レンズに一滴置き、イメージングチャンバーを顕微鏡の翻訳段階に置きます。サンプルが対物レンズに合うようにステージを調整し、撮像ソフトウェアの顕微鏡視点のキャリブレーションタブでフォーカスと表面をクリックして、目的レンズと凝縮レンズの軸方向の位置を調整します。
[自動]モードをクリックして、目的レンズと凝縮レンズを揃えます。アライメントを最適化するには、スキャンモードを開き、レンズを手動で調整して、デジタルマイクロミラーデバイスパターンを中央に合わせます。次に、標準モードに戻り、変換ステージを調整して、視野内のセルを見つけます。
対物レンズの軸方向の位置を調整して、画面で視覚化されたサンプル境界がほとんど見えなくなるまで焦点面を見つけます。最適な3DRIトモグラムを生成するために、セルの焦点を完全に調整することが重要です。画像が正しく撮影されないと、3D再構成が損なわれ、騒がしいトモグラムが生じます。
変換ステージを調整してセルのない位置を見つけ、[キャリブレーション]をクリックして、さまざまな照明角度を持つ複数の 2D ホログラムを測定します。変換ステージを調整して、視野の中央にセルを配置します。[取得] タブで、イメージ化するサンプルに名前を付けます。
[3D スナップショット]をクリックして、測定した 2D ホログラムと同じ照明角度を使用してセルのホログラムを測定します。取得したデータが [データ管理] パネルに表示されたら、データを右クリックして [プロセス] をクリックし、イメージング ソフトウェアに実装されているデ折断層撮影アルゴリズムを使用して、2D ホログラムから 3D 屈折インデックス断層を再構築します。イメージング後、[データ管理]パネルでデータを右クリックし、[開く]をクリックしてデータを視覚化します。
セルの中央をクリックして位置を変更し、データ・マネージャー・パネルの「RI」をクリックします。[プリセット] タブで [読み込み] をクリックし、リンパ球をダブルクリックします。xmlは、イメージングソフトウェアが提供する事前定義転送機能であり、3DRI分布に従ってトモグラムを可視化する。
マウスをスクロールして拡大し、セルをドラッグして任意の方向に回転させます。定量的形態学的および生化学的特徴抽出では、すべての断層データを単一のフォルダに配置し、メインフォルダ内の個々のサブフォルダ内でセルタイプを分割します。次に、適切な撮像ソフトウェアで補足機能抽出ファイルを開き、行14を編集して、データの抽出元のトモグラムフォルダを指定する。
15 行目を編集して、抽出されたフィーチャ データを保存するフォルダを指定し、コードを実行します。データセット内のすべてのトモグラムについて、コードは表面積、細胞容積、球数、球数、タンパク密度、および屈折率閾値あたりの乾燥質量を計算します。教師付き学習と識別のために、MATLABの単純なランダム分割アルゴリズムを使用して、抽出されたフィーチャデータを別々のトレーニングおよびテストセットフォルダにランダムに分割します。
補助トレーニング ファイルを開き、14 行目を編集してトレーニング セット フォルダを指定し、トレーニング済み分類子を保存するフォルダを指定する行 16、分類子のファイル名を設定する 17 行目を編集します。次に、コードを実行します。トレーニングセットの選択された機能を使用して、コードは K 最も近い近傍アルゴリズムを使用して分類子をトレーニングし、指定されたフォルダーに分類子を保存します。
次に、補助テスト ファイル 3 を開き、14 行目から 15 行目を編集して、トレーニング済みの分類子をテストする場合、17 行目を指定して、トレーニング済みのテスト セットを指定します。次に、コードを実行します。分類器は、テストセット内の個々のリンパ球の細胞タイプを識別する。
ここでBリンパ球の代表的な3Dレンダリング屈折率断血図、CD4陽性Tリンパ球、およびCD8陽性Tリンパ球が異なる配色で、イメージングソフトウェアを介して割り当てられた屈折率値に応じて割り当てが示されている。屈折率値から定量形態学的および生化学的特徴を算出することができる。この実験では、Tリンパ球とBリンパ球の分類の精度は、トレーニングとテストケースでそれぞれ93.15%と89.81%であった。
CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球は統計的に分類され、精度はそれぞれトレーニングセットとテストセットで87.41%と84.38%であった。最後に、多クラスの細胞型分類器の精度は、それぞれトレーニングステージとテストステージで80.65%と75.93%であった。この技術を成功させるためには、画像の品質と数が不可欠です。
画像の品質が高く、データ量が高いほど、識別精度が向上します。ディープラーニングを使用すると、より完全にトモグラムの複雑なデータを分析することができ、識別性能を高めることができます。また、蛍光および3D定量相イメージングを用いて、同定されたリンパ球の生理学的役割の経路を調べることができる。
その開発後、この技術は、細胞生物学と生物医学の分野の研究者が異なる生物の中で関心のある特定の疾患を探求する道を開いた。実際、特に免疫学者は、関心のある集団を特定するためにこの新しい技術を使用することから利益を得るかもしれない。
