F1-ATPaseの精製は、他のATP合成酵素によるATP生産のメカニズムを理解するために重要であることが証明された古典的な生化学的方法に基づいています。この技術の主な利点は、X線結晶学やクライオ電子顕微鏡による構造決定に適した高純度酵素を生成することです。このプロトコルは、トリパノソームからのF1-ATPaseの分離のために最適化されているが、それは、組織や培養細胞などの他の供給源、および様々な病原性プロニストに適応することができる。
この技術は、重篤なヒト疾患を治療するための新薬の同定につながる可能性がある。例えば、結核菌F-ATPaseは結核の治療のための認証された薬物標的である。プロトコルを開始するには、ミトプラストとも呼ばれるミトコンドリア小胞を解凍し、穏やかに再中断し、以前は低血圧リシスによって1回から10〜2倍の10倍から11倍の長周期トリパノソーマブルージーの11細胞に氷冷バッファーA.サンプルを冷やし続ける。
次に、製造者の指示に従って、ビチンチオン酸、またはBCA、タンパク質アッセイによって懸濁液中のタンパク質濃度を決定する。BSA希釈シリーズを超純水で行い、標準曲線を構築します。少量のサンプルを、BSA規格の範囲に収まるように、超純水で20~100倍希釈する。
サンプル中のタンパク質量の合計を計算した後、追加のバッファAで希釈して1ミリリットル当たり16ミリグラムにタンパク質濃度を持ち込み、その後、ミトプラストを反転小胞と膜片にそれぞれ15秒間超音波処理して7回断片化し、直径3.9ミリメートルのマイクロチップを持つマイクロチップを持つ1つの総エネルギーで70〜100ジュールの総エネルギーを使用します。断片化しながら、インパルスの間に30秒間氷上でサンプルをインキュベートします。超音波処理の後、サスペンションは少し暗く見えるかもしれません。
膜断片を54,000gで16時間、摂氏4度で5時間98,000gで超遠心分離して沈下する。上清をデカントし、クロロホルム抽出を進める。使用するバッファAの合計量に基づいてバッファBのボリュームを計算します。
冷凍沈水を遠心分離管からホモジナイザーに移します。小さなDounceホモジナイザーの助けを借りて、バッファBのミトコンドリア膜のペレットを再懸濁する。サスペンションを50ミリリットルの円錐チューブに移します。
氷からサンプルを取り除き、残りのステップのためにサンプルとすべての溶液を室温で保ちます。その後、HClで調整した2つのモルトリスで飽和したクロロホルムをpH 8.5に1対1で加えます。キャップをしっかりと閉じ、サンプルを20秒間激しく振ります。
直ちに混合物を室温で5分間8、400gで遠心する。次に、上側の濁水相を1.6ミリリットルマイクロチューブに移します。サンプルにプロテアーゼ阻害剤を加え、クロロホルム処理によって除去された阻害剤を置き換える。
試料を室温で30分間13,000gで遠心分離する。スピン後、上清を新鮮なマイクロチューブに移し、遠心分離を繰り返して残りの不溶性物質を除去する。280ナノメートルの吸光度が安定するまで、Qカラムバッファの50ミリリットルを1分間に5ミリリットルの流量で高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに取り付けた5ミリリットルのアニオン交換Qカラムを平衡化します。
平衡カラムに上清を1分あたり1ミリリットルの流量で積み込みます。280ナノメートルの吸光度が背景で安定するまで待ちます。Q カラム溶出バッファーの 25 ミリリットル線形勾配を 0% ~ 100% の流量 0.5 ミリリットル/分で適用し、1 ミリリットル分数を収集します。
pH8.0でプルマンATPaseアッセイによる反応混合物のミリリットル当たりATP加水分解活性に対するATP加水活性に対応する各個々の分画のアッセイ10マイクロリットル。ATPase アクティビティを示す分数をプールします。100,000分子量カットオフPESフィルターを用いたスピンカラムを用いて、膜外ろ過によってプールされたサンプルを200~500マイクロリットルに濃縮します。
その後、サイズ排除クロマトグラフィーに進みます。1分間に0.5ミリリットルの流量で少なくとも48ミリリットルのSECバッファーを有する液体クロマトグラフィーシステムに取り付けられたスーパーオース6増加カラムを平衡化する。列にサンプルを適用します。
0.25ミリリットルの分数を収集しながら、毎分0.25ミリリットルの流量でクロマトグラフィーを実行します。次に、SDS-PAGE上のUV280ナノメートル吸光度トレースのピークに対応する画分の10マイクロリットルを実行します。その後、クマシーブルーでサンプルを染色します。
プルマンATPaseアッセイによるATP加水分解活性およびアジ化感度に対するF1ピークを含む第1の主要ピークに対応する分数をアッセイする。次いで、BCAアッセイを行い、タンパク質濃度を決定する。最後に、精製したF1-ATPaseを室温に保ち、下流用途に精製してから3日以内に使用します。
この陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルは、溶出バッファー内の 280 ナノメートルの UV 吸光度と塩化ナトリウムの濃度を表示します。選択した分画をSDS-PAGEゲル上で分離し、クマシーブルー染料で染色した。アニオン交換クロマトグラフィーからの大溶出ピークに対応し、F1-ATPaseを含む画分をプールし、濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーの入力として使用した。
主な汚染物質はジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼであり、これは離散ピークとしてサイズ排除クロマトグラフィーカラムから溶出する。F1-ATPaseは、最初の支配的で、主に対称的なピークに溶出する。SDS-PAGEを介して精製されたF1-ATPaseを分離した後の典型的なバンドパターンのクマシーブルー染色は、アルファ3ベータ3ヘッドピース、ダイマーおよびオリゴマーのアルファ3つのヘッドピース、ダイマーおよびオリゴマーのサブ複合体を表すベータサブユニットの上に見える散発的な弱いバンドを示し、質量分析によって検出可能な汚染物質の欠損である。
クロロホルム抽出を行いながら、プロトコルの臨界工程を、試料を激しく振り、有機相と水相の遠心分離に直ちに進むのが不可欠である。この手順に従って、分離されたF1-ATPaseは質量分析法によって詳細に特徴づけることができる。また、活性アッセイまたは構造研究において、単独で、または種々の阻害剤または基質類似体の存在下で使用することができる。
