F1-ATPe'nin saflaştırılması, ATP üretiminin mekanizmasını diğer ATP sintraşları tarafından anlamamız açısından çok önemli olduğunu kanıtlayan klasik biyokimyasal yöntemlere dayanmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskobu ile yapı tayini için uygun son derece saf bir enzim üretmesidir. Bu protokol, F1-ATPaz'ın tripatozomlardan izole edilmesi için optimize edilmiş olsa da, doku veya kültür hücreleri gibi diğer kaynaklara ve çeşitli patojenik protistlere uyarlanabilir.
Bu teknik, ağır insan hastalıklarının tedavisinde yeni ilaçların belirlenmesine yol açabilir. Örneğin, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase tüberküloz tedavisi için doğrulanmış bir ilaç hedefidir. Protokolü başlatmak için, çözülme ve yavaşça mitokondriyal veziküller, ayrıca mitoplastlar olarak bilinen, daha önce hipotonik lysis tarafından bir kez izole 10 için 11-2 kez 10 prosiklik Trypanosoma brucei 11 hücreleri buz gibi soğuk Buffer A.Keep örnek soğutulmuş beş mililitre.
Daha sonra, bicinchoninic asit tarafından süspansiyon protein konsantrasyonu belirlemek, veya BCA, üreticinin talimatlarına göre protein tsay. Standart eğriyi oluşturmak için ultra saf suda BSA seyreltme serisi gerçekleştirin. BSA standartlarına uyacak şekilde numunenin küçük bir kısmını ultra saf suyla 20 ila 100 kez seyreltin.
Örnekteki toplam protein miktarı hesaplandıktan sonra, protein konsantrasyonunu ek Tampon A ile seyrelterek mililitre başına 16 miligrama getirin.Sonra mitoplastları ters veziküller ve membran parçalarına yedi kez sonication ile 15 saniye, toplam enerji ile 70 ila 100 joules impuls başına 3,9 milimetre çapında bir mikro ucu ile. Parçalama sırasında, impulslar arasında 30 saniye boyunca buz üzerinde örnek kuluçka. Sonication sonra, süspansiyon biraz daha koyu görünebilir.
Membran parçalarını ultrasantrifüj ile 16 saat veya 98,000 g'da ultrasantrifüj ile dört santigrat derecede beş saat boyunca tortulayın. Supernatant decant ve kloroform ekstraksiyon ile devam edin. Kullanılan Arabellek A'nın toplam miktarını temel alarak Arabellek B'nin hacmini hesaplayın.
Donmuş tortuyu santrifüj tüpünden homogenizer aktarın. Küçük bir Dounce homogenizer yardımı ile Tampon B mitokondriyal membranların pelet resuspend. Süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Numuneyi buzdan çıkarın ve kalan adımlar için numuneyi ve tüm çözümleri oda sıcaklığında tutun. Sonra pCl 8.5, bire bir HCl ile ayarlanmış iki azı tris ile doymuş kloroform ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve numuneyi tam olarak 20 saniye boyunca şiddetle sallayın.
Hemen oda sıcaklığında beş dakika boyunca 8, 400 g karışımı santrifüj. Daha sonra, üst, bulutlu sulu faz 1.6 mililitre mikrotüpler aktarın. Kloroform tedavisi ile çıkarılan inhibitörleri değiştirmek için numuneye proteaz inhibitörleri ekleyin.
Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 13,000 g'da santrifüj edin. Döndürmeden sonra, supernatant'ı taze mikrotüplere aktarın ve kalan çözünmez maddeleri çıkarmak için santrifüjünü tekrarlayın. Hızlı protein sıvı kromatografi sistemine bağlı beş mililitrelik anion değişimi Q sütununu dakikada beş mililitre likit bir akış hızıyla 280 nanometrede absorbans ve iletkenlik stabilize edene kadar dengeleyin.
Süpernatant'ı, dengelendirilen kolona dakikada bir mililitre lik bir akış hızıyla yükleyin. 280 nanometredeki emicilik arka planda stabilize olana kadar bekleyin. Q sütun elüsyon arabelleği 25 mililitre doğrusal gradyan uygulayın 0,5 mililitre lik bir akış hızıyla %0'dan %100'e kadar ve bir mililitre kesir toplayın.
PH 8.0'daki Pullman ATPase tsay'ın mililitre reaksiyon karışımında atp hidrolitik aktivitesi için ana elüsyon zirvesine karşılık gelen her bir fraksiyonun 10 mikrolitresini titretin. ATPaz aktivitesi sergileyen kesirleri birleştirin. 100,000 moleküler ağırlık kesme PES filtre ile 200-500 mikrolitre bir spin sütun kullanarak membran ultrafiltrasyon tarafından havuzlu örnek konsantre.
Daha sonra boyut dışlama kromatografisine devam edin. Dakikada 0,5 mililitre likit bir akış hızıyla en az 48 mililitre SEC tamponu içeren sıvı kromatografi sistemine bağlı Superose 6 Artış sütununa dengeleyin. Örneği sütuna uygulayın.
0,25 mililitre fraksiyonları toplarken, dakikada 0,25 mililitre lik bir akış hızında kromatografi çalıştırın. Daha sonra, SDS-PAGE'deki UV 280 nanometre emici izinin doruklarına karşılık gelen kesirlerin 10 mikrolitresini çalıştırın. Sonra coomassie mavi ile örnekleri leke.
Pullman ATPase tsay ile ATP hidrolitik aktivitesi ve azit duyarlılığı için F1 tepesini içeren ilk büyük tepeye karşılık gelen kesirleri teşp edin. Sonra protein konsantrasyonu belirlemek için bir BCA tayini gerçekleştirin. Son olarak, saflaştırılmış F1-ATPaz'ı oda sıcaklığında tutun ve aşağı akım uygulamaları için saflaştırmadan sonraki üç gün içinde kullanın.
Bir anion değişimi kromatografisinin bu elüsyon profili UV emiciliğini 280 nanometre de gösterir ve elüsyon tamponundaki sodyum klorür konsantrasyonunu gösterir. Seçilen kesirler SDS-PAGE jel üzerinde ayrılmış ve Coomassie Mavi boya ile boyanmış. Aniyon değişim kromatografisinden kaynaklanan ve F1-ATPe içeren majör elüsyon zirvesine karşılık gelen kesirler biraraya getirilmiş, konsantre edilmiş ve boyut dışlama kromatografisi için giriş olarak kullanılmıştır.
En büyük kirletici dihidrolipoyl dehidrogenazdır, bu da ayrık bir tepe olarak boyut dışlama kromatografisi sütunundan uzaktır. F1-ATPe ilk baskın, büyük ölçüde simetrik tepe de eutes. Saflaştırılmış F1-ATPaz'ın SDS-PAGE ile ayrılmasından sonra tipik bir bant deseninin Coomassie Blue boyaması, alfa üç beta üç başlık, dimers ve alfa ve beta alt birimlerinin alt komplekslerini temsil eden ve kütle spektrometresi ile tespit edilebilen kirleticilerden yoksun olan beta alt biriminin üzerinde görülen düzensiz zayıf bantları gösterir.
Protokolün kritik adımı olan kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirirken, numuneyi şiddetle sallamak ve organik ve sulu fazların santrifüj ayrımına hemen devam etmek esastır. Bu işlemden sonra izole F1-ATPaz kütle spektrometresi ile ayrıntılı olarak karakterize edilebilir. Ayrıca, aktivite tahlillerinde veya yapısal çalışmalarda, kendi başına veya çeşitli inhibitörlerin veya substrat analoglarının varlığında kullanılabilir.
