Die Reinigung von F1-ATPase basiert auf klassischen biochemischen Methoden, die sich als entscheidend für unser Verständnis des Mechanismus der ATP-Produktion durch andere ATP-Synthasen erwiesen haben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein hochreines Enzym produziert, das sich durch Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie zur Strukturbestimmung eignet. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von F1-ATPase von Trypanosomen optimiert ist, kann es an andere Quellen, wie Gewebe- oder Kulturzellen, und an verschiedene pathogene Protisten angepasst werden.
Diese Technik kann zur Identifizierung neuer Medikamente zur Behandlung schwerer menschlicher Krankheiten führen. Zum Beispiel ist Mycobacterium tuberculosis F-ATPase ein authentifiziertes Arzneimittelziel für die Behandlung von Tuberkulose. Um das Protokoll zu beginnen, tauen und sanft mitochondriale Vesikel, auch bekannt als Mitoplasten, früher durch hypotonische Lyse von ein mal 10 bis 11 bis zwei mal 10 bis zu den 11 Zellen der prozyklischen Trypanosoma brucei in fünf Millilitereiskaltepuffer A isoliert.
Als nächstes bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der Suspension durch die Bicinchoninsäure, oder BCA, Protein-Assay nach den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie eine BSA-Verdünnungsserie in reinem Ultrawasser durch, um die Standardkurve zu konstruieren. Verdünnen Sie eine kleine Menge der Probe 20 bis 100 Mal mit reinem Ultrawasser, um in den Bereich der BSA-Standards zu passen.
Nach der Berechnung der gesamten Proteinmenge in der Probe, bringen Sie die Proteinkonzentration auf 16 Milligramm pro Milliliter durch Verdünnung mit zusätzlichem Puffer A.Dann fragmentieren Sie die Mitoplasten in umgekehrte Vesikel und Membranstücke durch Beschallung sieben mal für jeweils 15 Sekunden, mit einer Gesamtenergie von 70 bis 100 Joule pro Impuls mit einer Mikrospitze mit einem Durchmesser von 3,9 Millimetern. Während der Fragmentierung, inkubieren Sie die Probe auf Eis für 30 Sekunden zwischen den Impulsen. Nach der Beschallung kann die Suspension etwas dunkler erscheinen.
Sedimentieren Sie die Membranfragmente durch Ultrazentrifugation bei 54 000 g für 16 Stunden oder bei 98 000 g für fünf Stunden bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand und fahren Sie mit der Chloroformextraktion fort. Berechnen Sie das Volumen von Puffer B basierend auf der Gesamtmenge des verwendeten Puffers A.
Das gefrorene Sediment aus dem Zentrifugenrohr in den Homogenisator geben. Setzen Sie das Pellet der mitochondrialen Membranen in Puffer B mit Hilfe eines kleinen Dounce Homogenisators wieder auf. Übertragen Sie die Suspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr.
Entfernen Sie die Probe aus dem Eis, und halten Sie die Probe und alle Lösungen bei Raumtemperatur für die verbleibenden Schritte. Dann chloroform gesättigt mit zwei Molaren tris mit HCl auf pH 8,5, eins zu eins eingestellt. Schließen Sie die Kappe fest, und schütteln Sie die Probe genau 20 Sekunden lang kräftig.
Die Mischung sofort bei 8, 400 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrieren. Übertragen Sie als Nächstes die obere, trübe wässrige Phase auf 1,6 Milliliter Mikroröhren. Fügen Sie der Probe Proteaseinhibitoren hinzu, um die durch die Chloroform-Behandlung entfernten Inhibitoren zu ersetzen.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 g für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Drehung den Überstand auf frische Mikroröhrchen übertragen und die Zentrifugation wiederholen, um das verbleibende unlösliche Material zu entfernen. Equilibrate die Fünf-Milliliter-Anionenaustausch Q-Säule, die an ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiesystem mit 50 Millilitern Q-Säulenpuffer mit einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute befestigt ist, bis sich die Absorption bei 280 Nanometern stabilisiert und die Leitfähigkeit stabilisiert wird.
Laden Sie den Überstand mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute auf die ausgeglichene Säule. Warten Sie, bis sich die Absorption bei 280 Nanometern im Hintergrund stabilisiert. Wenden Sie einen linearen Gradienten der Q-Spalte von 0 % bis 100 % bei einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute auf und sammeln Sie einen Milliliter-Anteil.
Assay 10 Mikroliter jeder einzelnen Fraktion entsprechend der Hauptelutionsspitze für DIE ATP-Hydrolytische Aktivität pro Milliliter Reaktionsmischung durch den Pullman ATPase-Assay bei pH 8,0. Poolen Sie die Brüche, die ATPase-Aktivität aufweisen. Konzentrieren Sie die gepoolte Probe durch Membran-Ultrafiltration mit einer Spinsäule mit einem 100.000 Molekulargewichts-Cutoff-PES-Filter auf 200 bis 500 Mikroliter.
Fahren Sie dann mit der Größenausschlusschromatographie fort. Equilibrate die Superose 6 Erhöhen Spalte an einem flüssigen Chromatographie-System mit mindestens 48 Milliliter SEC Puffer bei einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute befestigt. Wenden Sie das Beispiel auf die Spalte an.
Führen Sie die Chromatographie mit einer Durchflussrate von 0,25 Milliliterpro Minute aus und sammeln Sie dabei 0,25 Milliliter-Fraktionen. Als nächstes laufen 10 Mikroliter der Fraktionen, die den Spitzen der UV 280 Nanometer Absorptionsspur auf SDS-PAGE entsprechen. Dann färben Sie die Proben mit Coomassie Blue.
Assay die Brüche, die dem ersten großen Peak entsprechen, der den F1-Peak für die ATP-Hydrolytische Aktivität und die Azidempfindlichkeit durch den Pullman ATPase-Assay enthält. Führen Sie dann einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Halten Sie schließlich die gereinigte F1-ATPase bei Raumtemperatur auf und verwenden Sie sie innerhalb von drei Tagen nach der Reinigung für nachgeschaltete Anwendungen.
Dieses Elutionsprofil einer Anionenaustauschchromatographie zeigt die UV-Absorption bei 280 Nanometern und die Konzentration von Natriumchlorid im Elutionspuffer. Die ausgewählten Fraktionen wurden auf dem SDS-PAGE Gel abgetrennt und mit Coomassie Blue Farbstoff gefärbt. Die Fraktionen, die dem Hauptelutionsspitzen aus der Anionenaustauschchromatographie entsprechen und die F1-ATPase enthalten, wurden gepoolt, konzentriert und als Input für die Größenausschlusschromatographie verwendet.
Der Hauptschadstoff ist die Dihydrolipoyldehydrogenase, die aus der Farbtonographiesäule größe-Ausschluss als diskreter Peak elutiert. Die F1-ATPase elutiert in der ersten dominanten, weitgehend symmetrischen Spitze. Die Coomassie Blue Färbung eines typischen Bandmusters nach der Trennung der gereinigten F1-ATPase über SDS-PAGE zeigt sporadische schwache Bänder, die über der Beta-Untereinheit sichtbar sind, die Unterkomplexe der alpha drei Beta-Dreikopfgeräte, Dimere und Oligomere der Alpha- und Beta-Untereinheiten darstellen und frei von Verunreinigungen sind, die durch Massenspektrometrie nachweisbar sind.
Bei der Chloroformextraktion, dem entscheidenden Schritt des Protokolls, ist es wichtig, die Probe kräftig zu schütteln und sofort zur Zentrifugaltrennung der organischen und wässrigen Phasen überzugehen. Nach diesem Verfahren kann die isolierte F1-ATPase im Detail durch Massenspektrometrie charakterisiert werden. Darüber hinaus kann es in Aktivitätstests oder für Strukturstudien verwendet werden, entweder allein oder in Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren oder Substratanaloga.
