La purificación de F1-ATPase se basa en un método bioquímico clásico que demostró ser crucial para nuestra comprensión del mecanismo de producción de ATP por otras sintetizadoras ATP. La principal ventaja de esta técnica es que produce una enzima altamente pura adecuada para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o microscopía crioelectrólica. Aunque este protocolo está optimizado para el aislamiento de F1-ATPase de los tripanosomas, se puede adaptar a otras fuentes, como las células tisulares o de cultivo, y a varios protistas patógenos.
Esta técnica puede conducir a la identificación de nuevos medicamentos para tratar enfermedades humanas graves. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase es un objetivo farmacológico autenticado para el tratamiento de la tuberculosis. Para comenzar el protocolo, descongelar y resuspend suavemente vesículas mitocondriales, también conocidas como mitoplastas, previamente aisladas por lisis hipotónica de una por 10 a la 11 a dos veces 10 a las 11 células de Trypanoma brucei procyclic en cinco mililitros de Buffer A.Keep la muestra refrigerada.
A continuación, determinar la concentración de proteínas en la suspensión por el ácido bicinchoninico, o BCA, ensayo de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice una serie de dilución BSA en agua ultra pura para construir la curva estándar. Diluir una pequeña cantidad de la muestra de 20 a 100 veces con agua ultra pura para encajar en el rango de los estándares BSA.
Después de calcular la cantidad total de proteínas en la muestra, llevar la concentración de proteína a 16 miligramos por mililitro diluirlo con Tampón adicional A.Luego fragmentar los mitoplastos en vesículas invertidas y piezas de membrana por sonicación siete veces durante 15 segundos cada una, con una energía total de 70 a 100 julios por impulso con una microtip con un diámetro de 3,9 milímetros. Mientras se fragmenta, incuba la muestra sobre hielo durante 30 segundos entre impulsos. Después de la sonicación, la suspensión puede parecer ligeramente más oscura.
Sedimentar los fragmentos de membrana por ultracentrifugación a 54.000 g durante 16 horas o a 98.000 g durante cinco horas a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y proceder con la extracción de cloroformo. Calcule el volumen del búfer B en función de la cantidad total de búfer A utilizado.
Transfiera el sedimento congelado del tubo centrífugo al homogeneizador. Resuspender el pellet de las membranas mitocondriales en el búfer B con la ayuda de un pequeño homogeneizador Dounce. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros.
Retire la muestra del hielo y mantenga la muestra y todas las soluciones a temperatura ambiente para los pasos restantes. A continuación, agregue cloroformo saturado con dos tris molares ajustados con HCl a pH 8.5, uno a uno. Cierre bien la tapa y agite la muestra vigorosamente durante exactamente 20 segundos.
Centrifugar inmediatamente la mezcla a 8.400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera la fase acuosa superior y turbia a microtubos de 1,6 mililitros. Añadir inhibidores de la proteasa a la muestra para reemplazar los inhibidores eliminados por el tratamiento con cloroformo.
Centrifugar las muestras a 13.000 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del giro, transfiera el sobrenadante a microtubos frescos, y repita la centrifugación para eliminar cualquier material insoluble restante. Equilibrar la columna Q de intercambio de aniones de cinco mililitros unida a un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida con 50 mililitros de tampón de columna Q a un caudal de cinco mililitros por minuto hasta que la absorbancia a 280 nanómetros y la conductividad se estabilicen.
Cargue el sobrenadante en la columna equilibrada a un caudal de un mililitro por minuto. Espere hasta que la absorbancia a 280 nanómetros se estabilice en el fondo. Aplique un gradiente lineal de 25 mililitros del búfer de elución de columna Q de 0%a 100%a un caudal de 0,5 mililitros por minuto y recoja fracciones de mililitro.
Ensayo de 10 microlitros de cada fracción individual correspondientes al pico de elución principal para la actividad hidrolítica ATP por mililitro de mezcla de reacción por el ensayo Pullman ATPase a pH 8.0. Acoba las fracciones que exhiben actividad ATPase. Concentrar la muestra agrupada por ultrafiltración de membrana utilizando una columna de espín con un filtro PES de corte de peso molecular de 100.000 a 200 a 500 microlitros.
A continuación, proceda a la cromatografía de exclusión de tamaño. Equilibrar la columna Superose 6 Aumentar unida a un sistema de cromatografía líquida con al menos 48 mililitros de tampón SEC a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Aplique el ejemplo a la columna.
Ejecute la cromatografía a un caudal de 0,25 mililitros por minuto, mientras recoge fracciones de 0,25 mililitros. A continuación, ejecute 10 microlitros de las fracciones que corresponden a los picos de la traza de absorbancia de 280 nanómetros UV en SDS-PAGE. Luego tiñe las muestras con Coomassie Blue.
Ensayar las fracciones correspondientes al primer pico importante que contiene el pico de F1 para la actividad hidrolítica ATP y la sensibilidad azerí por el ensayo Pullman ATPase. A continuación, realice un ensayo de BCA para determinar la concentración de proteínas. Por último, mantenga el F1-ATPase purificado a temperatura ambiente y utilícelo dentro de los tres días posteriores a la purificación para aplicaciones posteriores.
Este perfil de elución de una cromatografía de intercambio de aniones muestra la absorbancia UV a 280 nanómetros y la concentración de cloruro de sodio en el tampón de elución. Las fracciones seleccionadas se separaron en el gel SDS-PAGE y se teñiron con tinte Coomassie Blue. Las fracciones que corresponden al pico de elución principal de la cromatografía de intercambio de aniones y contienen la F1-ATPase se agruparon, concentraron y se utilizaron como entrada para la cromatografía de exclusión de tamaño.
El principal contaminante es la dihidrolipoyl deshidrogenasa, que elue de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño como pico discreto. El F1-ATPase elue en el primer pico dominante, en gran parte simétrico. La tinción Coomassie Blue de un patrón de banda típico después de la separación de la F1-ATPase purificada a través de SDS-PAGE muestra bandas débiles esporádicas visibles por encima de la subunidad beta, que representan suplentes de la tocado alfa tres beta tres, dimers y oligómeros de las subunidades alfa y beta, y están desprotegidas de cualquier contaminante detectable por espectrometría de masas.
Durante la realización de la extracción de cloroformo, el paso crítico del protocolo, es esencial agitar la muestra vigorosamente y proceder a la separación centrífuga de las fases orgánica y acuosa inmediatamente. Siguiendo este procedimiento, el aislado F1-ATPase se puede caracterizar en detalle por espectrometría de masas. Además, se puede utilizar en ensayos de actividad o para estudios estructurales, ya sea por sí solo o en presencia de diversos inhibidores o análogos de sustrato.
