この方法は、ミトコンドリアの健康、エネルギー効率、エネルギー使用量など、エネルギー分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、単離ミトコンドリアの酸素消費量が直接測定されるということです。結果は、他の細胞内代謝プロセスのために修正する必要はありません。.
まず、ミトコンドリア効率が飼料効率にどのような影響を与えるかを調べたいとき、私たちは乳牛でこの方法を追求することにしました。ミトコンドリア分離の手順は一貫性があり、正確である必要があるため、習得が困難であるため、この方法のビデオデモンストレーションは重要です。肝臓サンプルを取り除いた後できるだけ早く、赤血球を除去するためにミトコンドリアの分離培地で試料を洗浄する。
はさみを使用して、組織を湿らせた状態に保つために十分な分離培地を含む冷たいビーカーに組織を細かくミンチします。ひき肉をミトコンドリア分離培地を含む30ミリリットルガラスバイアルに移します。0.16ミリメートルのクリアランスを有し、氷でインキュベートされたテフロン害虫を加え、1分間4ストロークで1分間500 RPMで肝臓サンプルを均質化します。
この後、ホモジネートをミトコンドリア分離培地を含むチューブに移し、これを氷パックビーカーに入れる。遠心分離機はGの500倍、摂氏4度で10分間ホモジュートする。ペレットを捨てて、上清を冷やした遠心分離管に移します。
得られた上清を10,000倍Gで4度摂氏10分間遠心し、ミトコンドリアペレットを得た。ペレットを再中断し、10 ミリリットルのミトコンドリア分離培地に脂肪酸を含まない BSA で洗浄します。その後、8、100倍G、摂氏4度で10分間遠心分離機を使用します。
上清を捨て、200マイクロリットルの分離媒体でペレットを再懸濁します。酸素消費と陽子漏れ運動アッセイに使用する準備ができるまで氷の上に置きます。BSAを標準として使用するメーカーの指示に従ってビチオニン酸キットを使用して、ペレット懸濁液のタンパク質濃度を決定します。
まず、テキストプロトコルで概説されているように、酸素消費媒体を作成します。酸素消費媒体を摂氏30度でインキュベートする。次に、製造業者の指示に従って、オキシグラフシステム用の呼吸室、ポンプおよび酸素電極を設置する。
その後、酸素消費媒体の1ミリリットルを呼吸室に入れます。その後、ミトコンドリアタンパク質の0.35ミリグラムをチャンバーに加えます。溶液が空気で飽和し、摂氏30度の温度を維持するために激しくかき混ぜます。
約5分間の酸素消費量を記録します。酸素消費量が一定になると、一定の直線が表され、これをベースライン酸素消費量として記録します。複雑な1つを阻害するために4ミリモルロテノーン溶液の1.25マイクロリットルを追加し、その後、呼吸器室でコハク酸5ミリモルの最終的な濃度に達するために1モルコハク酸溶液の5マイクロリットルを追加します。
これは、状態IV酸素消費です。この後、100ミリモルADP溶液の1マイクロリットルを加えて、呼吸室に100マイクロモルの最終濃度に達する。酸素消費量は約5分間減少し、その後、直線になります。
この酸素消費量を状態III呼吸として記録します。テキストプロトコルで概説されているように、呼吸制御比を計算します。その後、呼吸室からすべての溶液を吸引します。
二重脱イオン水でチャンバーを数回リンスします。まず、エタノール中のニジェリシン1ミリリットル当たり80ナノグラムの溶液を調製し、エタノールの添加量を1マイクロリットル未満に制限する。また、エタノール中に1ミリリットルオリゴマイシン当たり8マイクログラムの溶液を調製する。
チャンバーを二重脱イオン水で十分に洗い流した後、酸素消費媒体の1ミリリットルを呼吸室に入れ、磁気攪拌棒で激しくかき混ぜます。呼吸室に0.35ミリグラムのミトコンドリアタンパク質を加える。メチルトリフェニルホスホニウム感受性電極をチャンバ設定に追加して、もう一方の端がpHメーターに正しく接続されていることを確認します。
4ミリモルロテノーネ溶液の1.25マイクロリットルを加え、コンプレックスI.2〜5分間呼吸を記録します。酸素消費量が一定になったときに、酸素消費量の値を記録します。次に、0.56マイクロリットルのオリゴマイシン溶液を加えて、ADPの利用を阻害する。
呼吸を約2~5分間記録します。酸素消費量が一定になったときに、酸素消費量の値を記録します。その後、ミトコンドリア内膜全体のpH勾配を廃止するために、ミリリットルニジェリシン溶液あたり80ナノグラムの0.112マイクロリットルを追加します。
呼吸を2~5分間記録し、一定になったときに酸素消費量の値を記録します。ミトコンドリアインキュベーションに10ミリモルメチルトリフェニルホスホニウム溶液を5マイクロリットル加えて、標準曲線の調製を開始します。合計濃度が 2.5 になるまで、この追加を 4 回繰り返します。
マイクロモルが追加されました。この後、1つの大臼歯コハク酸溶液を5マイクロリットル加えて呼吸を開始します。安定したトレースが達成されるまで呼吸を記録します。
次に、テキストプロトコルで概説されているように、システムを調整するためにmalonateを追加します。本研究では、乳牛に28日間異なるレベルの銅、亜鉛、マンガンを供給してから70日後に、ホルスタイン乳牛の乳中でRCRおよびプロトンリークキネティックスが測定される。状態IV呼吸は、マンガンの低レベルを与えられた牛の中で最も高いと見られるが、対照牛では最も低く、マンガンがプロトン漏れ依存性呼吸を最小限に抑える上で重要な役割を果たしていることを示している。
肝プロトンリーク依存呼吸の分析は、この呼吸が低いマンガンで治療された牛で最も大きく、対照牛で最も低いことを明らかにした。これらの結果は、低マンガン群が最も高い状態IV呼吸を有し、対照群が最も低い状態であることを確認した。高RFI雄牛よりも低RFIブルから生まれたアンガスステアでは供給効率が高いが、これはミトコンドリアRCRまたはプロトンリークキネティクスには反映されなかった。
この手順を実行している間、ミトコンドリアを処理しながら、氷の上にすべてのバイアルとビーカーを維持することが重要です。その開発後、この技術は、肝臓の飼料効率とミトコンドリア機能におけるミトコンドリア効率の役割を探求するために、乳製品栄養の分野の研究者のための道を開きました.ロテノーネで作業することは危険であり、手袋、目の保護、適切なPPEの着用などの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
