移動式ミトコンドリア実験室の開発により、生理学者は自分の研究を現場に持ち込むことができ、その結果、動物が示すエネルギー的な課題の魅力的な多様性を評価することができます。飼育は多くの動物にとってストレスとなるため、移動式ラボでは、動物を実験室に連れ戻すのではなく、実験室を動物のところに持って行くことができます。現場でミトコンドリア呼吸を分離して測定する能力により、主に生物医学で使用されていた技術が、生態学的および進化的な文脈で使用できるようになりました。
まず、移動式実験室を平らな地面に駐車し、次に発電機をオンにして、車両を水平にします。機器を設置する前にスライドを伸ばしてください。ミトコンドリア呼吸チャンバーをセットアップし、メーカーの指示に従って、実験の希望の温度と現在の気圧に校正します。
カットした5ミリリットルのピペットチップを使用して、ミンチにした組織を50ミリリットルの遠心チューブに移し、ブレードで50%の出力で5秒間組織をホモジナイズします。組織を消化するには、湿った筋肉1グラムあたり5ミリグラムのプロテアーゼを7分間添加し、30秒ごとに溶液を混合します。BSAを含む等量の単離バッファーを添加して反応を終了します。
次に、ホモジネートを500 Gで10分間遠心分離し、次に、カットした5ミリリットルのピペットチップを使用して上清を2層のチーズクロスを通して清潔な50ミリリットルの遠心分離管に移し、次に、ろ過した上清を3、500 Gで10分間遠心分離して、茶色のミトコンドリアペレットを沈殿させます。上清を廃棄した後、BSAを含む同量の単離バッファーを遠心分離管に加え、ミトコンドリアペレットを遠心分離管の壁から静かに離して可撓性スクレーパーでミトコンドリアペレットを再懸濁し、3, 500Gで10分間遠心分離します。ペレットをBSAを含まない単離バッファーに再懸濁し、前述の遠心分離ステップを繰り返します。
2回目の遠心分離後、ミトコンドリアペレットを清潔で柔軟なスクレーパーで再懸濁バッファーに再懸濁し、再懸濁したミトコンドリアを1ミリリットルのピペットチップをカットしたDounceホモジナイザーに移します。ホモジナイザーを用いて、ミトコンドリア懸濁液を4〜5回のパスで慎重にホモジナイズします。新しくカットした1ミリリットルのピペットチップを使用して、ホモジナイズしたミトコンドリア懸濁液をラベル付きの2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
複合体1基質のミトコンドリア呼吸測定のために、ミトコンドリア呼吸チャンバーに945マイクロリットルの呼吸緩衝液を添加する。バッファー温度が摂氏 37 度に保たれているときに、攪拌機が回転していることを確認します。チャンバーを上部で密閉し、データ収集の記録を開始します。
酸素濃度が安定したら、20マイクロリットルのミトコンドリア懸濁液をチャンバーに加え、蓋をします。ソフトウェアでは、ミトコンドリアがチャンバーに追加されたことを示します。グルタミン酸1モル、リンゴ酸200ミリモル、ピルビン酸200ミリモルをそれぞれ10マイクロリットルずつ、個々のシリンジでチャンバーに加え、シグナルが安定するまで待ってから、添加した基質をソフトウェアに表示します。
別のシリンジを使用して、5マイクロリットルのアデノシン二リン酸(ADP)をチャンバーに加えます。追加されたADPをソフトウェアで示し、状態3の急速な酸素消費量を観察します。状態 3 の呼吸とミトコンドリアの酸素消費量が 4 分間遅くなり、状態 4 の呼吸を示した後、記録を終了し、データ ファイルを保存します。
複合体2基質の場合、963マイクロリットルの呼吸緩衝液をチャンバーに追加して手順を繰り返します。20マイクロリットルのミトコンドリア懸濁液を添加した後、別々のシリンジを使用して、1マイクロリットルあたり4マイクログラムのロテノンと500ミリモルのコハク酸10マイクロリットルの2マイクロリットルをチャンバーに順次加える。信号が安定したら、ソフトウェアで基板の追加を示します。
5マイクロリットルのADPを添加して、状態3の急速な酸素消費を観察し、ソフトウェアでADPの添加を示します。状態 3 の呼吸とミトコンドリアの酸素消費量が 4 分間遅くなり、状態 4 の呼吸を示した後、記録を終了し、データ ファイルを保存します。代表的な結果は、生のミトコンドリア呼吸データを示しています。
複合体1基質のステップ3の急勾配は、高い最大呼吸数を表しています。後肢の骨格筋からのミトコンドリアの分離の成功は、状態4の急激な回転と新しい傾斜の安定化によって観察されました。同様のパターンは、複雑な2つの駆動ミトコンドリア呼吸でも観察できます。
ミトコンドリアの貧弱な機能は複雑なもののためのミトコンドリアのカップリングで起因した 運転されたミトコンドリア呼吸.しかし、ミトコンドリア機能不良の別の典型例は、ADP添加後の平坦な線で非結合複合体の2つのミトコンドリア呼吸を示し、順番が回らずに状態4のデータを生成した。複合体1および複合体2の両方について、状態3、状態4、および呼吸制御比(RCR)の数値を、呼吸測定データから決定した。
さらに、手順の後、単離されたミトコンドリアを凍結して、電子輸送および鎖複合体の活性を測定することもできます。野外でミトコンドリア呼吸を分離・測定する能力は、複雑な生命の進化におけるミトコンドリアの役割についての理解を深める道を開くでしょう。
