この方法は、マウス胚性幹細胞における相同組換え事象の同定など、分子および細胞生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが正確で信頼性が高く、広く使用されているということです。したがって、この方法は、マウス胚性幹細胞における相同組換え事象の同定に関する洞察を提供することができる。
また、遺伝子組み換え細胞や動物などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法の新しい個々の方法は、時間がかかり、複数のステップを伴うため、苦労します。各gDNAについて、DRA 1個につき10×バッファの30マイクロリットル、DRA 1マイクロリットル3マイクロリットル、サンプルあたり10マイクログラムのgDNAを混合します。
最終的な体積が30マイクロリットルになるまで水を加え、一晩摂氏37度でインキュベートしてgDNAを消化します。臭化エチジウムを用いて1%アガロース電気泳動ゲルを調製する。以前に取得したサンプルを1 KBのラダーと一緒にゲルにロードし、一晩で30〜40ボルトで実行します。
翌日、ゲルを0.2ニュートン塩酸溶液を含むトレイに浸します。シェーカーを使用して、室温で20分間やさしくトレイを振ります。DNA変性溶液を含むトレイにゲルを移します。
室温で20分間やさしく振ります。次に、DNA中和溶液を含むトレイにゲルを移します。そして、室温で20分間やさしく振ります。
急速な下方移動システムを使用して、膜にゲルからDNAを移す。次に、製造元が提供する手順に記載されているように、ターブルブロッターとブロッティングスタックを組み立てます。この後、膜を取り出し、2つのX生理塩水ナトリウムで1分間洗浄します。
組織で液体を吸収し、次にUV架橋機を使用してDNAと膜を架橋する。DNAプローブに放射能を付け始めるには、DNA標識ビーズを含むチューブに熱変性プローブDNAを追加します。ピペットを上下に混ぜ合わせます。
そして、放射性標識デオキシシトジン三リン酸の5マイクロリットルを追加します。摂氏37度で15分間インキュベートします。メーカーから提供される指示に従ってG 50マイクロカラムを使用して、標識されたプローブを精製します。
放射能を測定するためにシンチレーションカウンターを使用してください。標識されたプローブで膜のハイブリダイジングを開始するには、その膜をハイブリダイゼーションチューブに入れる。混合プレハイブリダイゼーションソリューションを追加します。
チューブをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、プレハイブリダイゼーションを摂氏42度で30分間進めます。次いで、オーブンからチューブを取り出し、50ミリリットルのチューブにプレハイブリダイゼーション溶液を注ぎます。変性したプローブを加え、軽く混ぜます。
非ハイブリダイズプローブを除去するには、0.1%SDSのクエン酸X生理食塩水ナトリウム1個を含むトレイに膜を入れ、摂氏55~60度で10分間静かに振ります。その後、膜をラップで包み、露出カセットに固定します。暗い部屋で、膜を2枚のX線フィルムにさらします。
結果を可視化するフィルムを開発する。プローブによって検出されたDNAバンドのサイズに応じて、対応するESクローンが再結合のターゲットを持つ所望のものかどうかを判断します。本研究では、サザンブロッティングおよびPCRを用いて、ES細胞を用いたHRを媒介した標的化技術を用いて、NM2つの遺伝的置換マウスモデルを生成するためにマウスES細胞で発生するHR事象を同定する。
ゲノムDNAは、異なる長さの多くの断片に切断されるため、DNAゲルにスミアのような状態を示す。これは、ゲノムのドナの完全な消化を示唆しています。サザンブロッティングの最終ステップとして、放射性標識プローブ標識プローブのシグナルが、標的DNA断片とハイブリダイム化してフィルム上に示されている。
期待されるバンドの出現は、ESクローンにおけるHRイベントの発生を反映しています。研究のプレデザインによると、変異したアリールを有するESクローンは、2つの異なるサイズのバンドを有する。野生型ESクローンは1つのバンドしか持っていませんが、所望のESクローンはヘテロ接数であることを示唆しています。
PCR反応の後、PCR産物をDNAゲルで分析することができます。正しいサイズの特定のNPCRバンドが観察された場合、これは、そのPCRバンドをシーケンシングすることによってさらに確認することができるHRイベントの発生を示唆する。この技術の意味は、基礎が同一であるため、点突然変異を同定する治療にまで及んだ。
この手順を試みる間、忍耐強く、注意することを忘れないでください。この手順に従って、ES細胞を胚盤胞へのマイクロインジェクションのような他の方法は、キメラ動物の形成のような追加の質問に答えるために行うことができる。この技術は、分子および細胞生物学の分野の研究者が、特定の遺伝子の機能やマウスまたはその先の変異遺伝子の結果を探求する道を開いた。
放射能標識者P32 DCTBを使用することは非常に危険であり、保護ボードでシールドなどの予防措置は、この手順を実行している間、常に取るべきであることを忘れないでください。
