この方法は、炎症と免疫学の分野で重要な質問に答えることができます。例えば、白血球接着と経内皮移動の分子機構は何ですか。この技術の主な利点は、それが半透明単層への単球のトランスマイグレーションと強い付加との間の無制限の使用の差別を可能にすることです。
この方法は、流れ上の単球の採用に関する情報を提供するが、T細胞、B細胞、またはその亜集団の誘導体のような造血系の他の細胞にも適応することができる。洗浄後、37°Cおよび5%炭酸ガスで10分間1マイクロモルCMFDAを添加した30マイクロモルM199培地の30マイクロリットルでヒト臍静脈内皮細胞またはHUVECにラベルを付けます。インキュベーションの終わりに、完全なM199培地の150マイクロリットルで細胞を洗浄し、さらに30分間新鮮な完全なM199培地の150マイクロリットルで培養をインキュベートします。
次に、上清を適切な実験用サプリメントを含む完全なM199培地の150マイクロリットルに交換し、スライドチャンバー培養液を6時間インキュベーターに戻します。ヒトPAN単球単球分離の場合、1対1の比率で1ミリモルEDTAを添加したPBSで採取した新しい血液サンプルを希釈し、遠心分離による密度勾配分離のために20mlの密度勾配培地上に20mlの血液溶液を慎重に層化する。中末梢血単核細胞血小板層を1ミリモルEDTAで補った40mlのPBSを含む新しい50mlチューブに集め、追加のPBS-EDTAで最終体積を50mlに持ち込み、数えた後、メーカーの指示に従ってPAN単球分離キットで単球を単球に分離する。
そして、0.5%牛血清アルブミン、またはBSAを添加したM199培地で細胞を3回洗浄して、EDTAの痕跡を排除する。単球分離の品質は、堅牢なトランスマイグレーションと接着結果を確保するために重要です。したがって、分離のためのメーカーの勧告に厳密に従うことが重要です。
0.5%BSAを補充した新鮮なM199培地中のml濃度当たり6倍の10倍の10回でペレットを再懸濁し、細胞を採用アッセイ当て試算1回当たりのマイクロ遠心分離管当たり1つの200マイクロセントリコートに分割する。その後、フローチャンバーへの注入の前に20分間、セルを摂氏37度に置きます。分析用の流体システムを準備するには、まず、長さ8cmの3mm厚いシリコンチューブの一方の端にオスのルアーコネクタを挿入し、もう一方の端をインラインルアーインジェクションセットに接続します。
その後、ルアーコネクタを長さ40cmの3mm厚いシリコンチューブの一端に接続します。次に、20mmシリンジを長さ1mの厚さ3mmのシリコンチューブの一方の端に、オスのルアーコネクタをもう一方の端に挿入します。次に、両方の男性ルアーコネクタを女性のルアーロックカプラに挿入し、シリコーンチューブのフリーエンドを0.5%BSAを補った37°CM199培地の貯水池に入れ。
プランジャーを引き込んで、チューブをフローバッファで満たし、シリンジポンプのシリンジを固定します。次に、ポンプを引き出しモードに設定し、流量を指定します。スライドチャンバーを接続するには、女性のルアーロックカプラの周りにシリコーンチューブをクランプし、それらをスライドのリザーバに接続できるようにカプラーから2つのルアーコネクタオスを取り外します。
気泡は画質を乱すだけでなく、毛細血管の薄いストレスを細胞に誘導し、細胞死を引き起こす。気泡を避けるために、貯蔵所にルアーを挿入する前に管の正しいクランプを確認しなさい。次にクランプを取り外して、接続が漏れていないことを確認し、スライドを顕微鏡の下に置きます。
フロー下での単球募集のイメージングのために、5マイクロリットルの蛍光結合抗CD16抗体と適切な核染色を各アリクォート単球に室温で10分間インキュベーションし、短い遠心分離で細胞を収集する。250マイクロリットルのフローバッファでペレットを再懸濁し、シリンジポンプを開始します。スライドの1つのチャンバーに1つの単球懸濁液の30マイクロリットルを加え、共焦点顕微鏡の40X目的を選択します。
適切な蛍光レーザーをアクティブにし、ラベル付き単球でチャンバーを使用して共焦点顕微鏡の取得パラメータを設定する次へ、マルチポジション共焦点イメージングのために半径半センチメートル以内の3つの視野を選択し、Zスタックを10〜12マイクロメートルの範囲に設定し、時間取得を1分ごとに実行します。3分間のイメージングの後、インラインルアー注入口を通して200マイクロリットルの単球を注入し、細胞相互作用のイメージングを開始する。少なくとも30分後、撮像と流れを止め、チューブをクランプしてスライドから切り離せるようにします。
刺激されたHUVECを介した細胞の転写速度を決定するために、画像Jを開き、各フィールドの接着単球の総数をカウントして、1平方ミリメートルあたりの細胞数を決定する。次に、核の周りにブラックホールゾーンが存在することによって識別されるように、内皮細胞の下の基底面に存在するトランスマイグレーションされた単球の数を数えます。刺激後のHUVECsの活性化状態を確認する簡単な方法は、炎症性ストレス下でのそれらの伸びの視覚化です。
タイムラプス共焦点イメージングは、その表現型を評価することができる尖体面での単球の可視化を可能にする。トランスマイグレーションを受けている移動細胞は、尖体面から消失して基底面に再び現れる前に、細胞間細胞間接合部に移動する。時間の経過に伴う単球の採用の定量化は、単球接着が続いてトランスマイグレーションされることを確認する。
CD16陽性単球のトランスマイグレーション率は、内皮細胞がTNFアルファのみで刺激される場合には低いが、内皮細胞がTNFアルファおよび血管内皮成長因子またはVEGFAの両方で刺激されると増加する。TNFαおよびTNFアルファ+VEGFAを有するHUVEC刺激は、CD14陰性T、BおよびNK細胞への付着の増加を誘導し、CD14陽性単球と比較する。さらに、HUVEC刺激は、T、BおよびNK細胞がTNFアルファまたはTNFアルファプラスVEGFA刺激条件下でトランスマイグレーションを行わないので、単球集団の単球集団の単一の移動のみを誘導する。
最適な単球採用アッセイを行うには、実験を事前に計画し、同じ日に行うことが重要です。また、細胞を精製する際には、実験中に細胞を異なる温度に変換しないように、顕微鏡が37度であることを確認してください。この手順を学ぶために、HUVECサイトカインおよびケモカイン発現のプロファイリングおよび化学血軸研究のようなすべての方法は、特定の単球集団の移行および接着を維持する分子メカニズムに関する追加の質問に答えるために行うことができる。
