Para este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en el campo de la inflamación y la inmunología. Por ejemplo, ¿cuáles son el mecanismo molecular de la adhesión de leucocitos y la migración trans-endotelial. La principal ventaja de esta técnica es que permite la discriminación de uso ilimitado entre la transmigración y la fuerte adición de monocitos a la monocapa endotelial.
Aunque este método proporciona información sobre el reclutamiento de monocitos en el flujo, también se puede adaptar a otras células de los sistemas hematopoyéticos como células T, células B, o derivados de la subpoblación de los mismos. Después del lavado, etiqueta las células endoteliales de la vena umbilical humana o HUVEC con 30 microlitros de 37 grados Celsius M199 medio complementado con un CMFDA micromolar durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5%Dióxido de carbono. Al final de la incubación, lavar las células con 150 microlitros de medio M199 completo e incubar el cultivo en 150 microlitros de medio M199 fresco completo durante otros 30 minutos.
A continuación, reemplace el sobrenadante con 150 microlitros de medio M199 completo que contenga los suplementos experimentales apropiados y devuelva el cultivo de la cámara deslizante a la incubadora durante seis horas. Para el aislamiento de monocitos PAN humanos, diluya una muestra de sangre recién recogida en PBS complementada con un EDTA milimétrico en una proporción de uno a uno y caparya cuidadosamente 20 ml de la solución sanguínea en 20 ml de medio de gradiente de densidad para la separación de gradiente de densidad por centrifugación. Recoger la capa plaquetaria de células mononucleares de sangre periférica media en un nuevo tubo de 50 ml que contenga 40 ml de PBS complementado con EDTA 1 milimolar y llevar el volumen final a 50 ml con PBS-EDTA adicional Después de contar, aislar los monocitos con el kit de aislamiento de monocitos PAN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Y lavar las células tres veces en el medio M199 complementado con 0.5%Búbrico Suero Bovino, o BSA, para eliminar cualquier rastro de EDTA. La calidad del aislamiento de monocitos es fundamental para garantizar un resultado robusto de transmigración y adhesión. Por lo tanto, es importante seguir estrictamente la recomendación del fabricante para el aislamiento.
Resuspender el pellet en un 6 veces 10 a los 6 monocitos por ml de concentración en medio M199 fresco complementado con 0.5%BSA y dividir las células en una alícuota de 200 microlitros por tubo de microcentrífuga por ensayo de reclutamiento. Luego coloque las células a 37 grados Celsius durante 20 minutos antes de la inyección en la cámara de flujo. Para preparar el sistema fluido para el análisis, inserte primero un conector luer macho en un extremo de una pieza de tubo de silicona de 8 cm de largo y 3 mm de espesor y conecte el otro extremo a un conjunto de inyección de luer en línea.
A continuación, conecte el conector luer a un extremo de una pieza de tubo de silicona de 40 cm de largo y 3 mm de espesor. A continuación, la jeringa de 20 mm a un extremo de una pieza de tubo de silicona de 1 m de largo y 3 mm de espesor e inserte un conector de luer macho en el otro extremo. A continuación, inserte ambos conectores de luer macho en un acoplador de bloqueo luer hembra y coloque el extremo libre del tubo de silicona en un depósito de 37 grados Celsius M199 medio complementado con 0.5%BSA.
Retirar el émbolo para llenar el tubo con el búfer de flujo y fijar la jeringa en la bomba de la jeringa. A continuación, ajuste la bomba al modo de retirada y especifique el caudal. Para conectar la cámara deslizante, sujete el tubo de silicona alrededor del acoplador de bloqueo luer hembra y desconecte los dos machos del conector luer del acoplador para permitir que se conecten al depósito de la corredera.
Las burbujas de aire no sólo perturban la calidad de la imagen, sino que también inducen estrés capilar a las células, lo que conduce a la muerte celular. Para evitar burbujas de aire, confirme la sujeción correcta del tubo antes de insertar el luer en el depósito. A continuación, retire las abrazaderas para confirmar que la conexión no tiene fugas y coloque la diapositiva debajo del microscopio.
Para obtener imágenes del reclutamiento de monocitos bajo flujo, agregue 5 microlitros de anticuerpos anti CD16 conjugados con harina y un tinte nuclear adecuado a cada monocitos alícuotas para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente y recoja las células con una breve centrifugación. Resuspender el pellet en 250 microlitros de búfer de flujo e iniciar la bomba de la jeringa. Agregue 30 microlitros de una suspensión de monocitos a una cámara de la corredera y seleccione el objetivo 40X en el microscopio confocal.
Active los láseres fluorescentes adecuados y utilice la cámara con el monocitos etiquetados para establecer los parámetros de adquisición del microscopio confocal Next, seleccione tres campos de visión en un radio de medio centímetro para imágenes confocales de varias posiciones y establezca una pila Z en el rango de 10 a 12 micrómetros y la adquisición de lapso de tiempo para que se ejecute cada minuto. Después de tres minutos de imágenes, inyecte 200 microlitros de monocitos a través del puerto de inyección de luer en línea y comience a tomar imágenes de la interacción celular. Después de al menos 30 minutos, detenga la imagen y el flujo y sujete el tubo para permitir que se desconecte de la diapositiva.
Para determinar la tasa de transmigración de las células a través de los HUVEC estimulados, abra la imagen J y cuente el número total de monocitos adherentes en cada campo para determinar el recuento de celdas por milímetro cuadrado. A continuación, cuente el número de monocitos transmicrados que están presentes en el plano basal debajo de las células endoteliales identificados por la presencia de una zona de agujero negro alrededor del núcleo. Una forma sencilla de comprobar el estado de activación de los HUVEC después de la estimulación es visualizar su elongación bajo estrés inflamatorio.
Las imágenes confocales de lapso de tiempo permiten visualizar los monocitos en el plano apical donde se puede evaluar su fenotipo. Las células migratorias sometidas a transmigración se mueven a la unión intercelular de célula a célula antes de que desaparezcan del plano apical y reaparezcan en el plano basal. La cuantificación del reclutamiento de monocitos a lo largo del tiempo confirma que la adhesión de monocitos es seguida por la transmigración.
La tasa de transmigración del monocitos positivos CD16 es baja cuando la célula endotelial se estimula con TNF alfa solamente, pero aumenta cuando las células endoteliales se estimulan con TNF alfa y factor de crecimiento endotelial vascular o VEGFA. La estimulación HUVEC con TNF alfa y TNF alfa más VEGFA induce un aumento en la adherencia a las células T, B y NK negativas CD14, en comparación con los monocitos positivos CD14. Además, la estimulación HUVEC induce la transmigración de la población de monocitos solamente, ya que las células T, B y NK no transmigran en condiciones de estimulación TNF alfa o TNF más VEGFA.
Para realizar un ensayo óptimo de reclutamiento de monocitos, es importante que planee su experimento con antelación y lo haga en el mismo día. Y cuando purifique las células, asegúrese de que su microscopio esté a 37 grados para que no transfiera las células a diferentes temperaturas durante el experimento. Para aprender este procedimiento, se pueden realizar todos los métodos como el perfilado de la expresión de citoquinas HUVEC y quimiocina, así como los estudios de quimiotaxis para responder a preguntas adicionales sobre el mecanismo molecular que sostienen la transmigración y adhesión de la población específica de monocitos.
