Per questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione e dell'immunologia. Ad esempio, quali sono il meccanismo molecolare dell'adesione dei leucociti e della migrazione trans-endoteliale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una discriminazione d'uso illimitata tra trasmigrazione e forte aggiunta di monociti al monostrato endoteliale.
Sebbene questo metodo fornisca informazioni sul reclutamento di monociti sul flusso, può anche essere adattato ad altre cellule dei sistemi ematopoietici come cellule T, cellule B o derivati della sottopopolazione di esso. Dopo il lavaggio, etichettare le cellule endoteliali della vena ombelicale umana o HUVEC con 30 microlitri di 37 gradi Celsius M199 media integrati con un CMFDA micromolare per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5%anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 150 microlitri di mezzo M199 completo e incubare la coltura in 150 microlitri di mezzo M199 fresco completo per altri 30 minuti.
Sostituire quindi il supernatante con 150 microlitri di mezzo M199 completo contenente gli opportuni integratori sperimentali e restituire la coltura della camera di scorrimento all'incubatore per sei ore. Per l'isolamento dei monociti PAN umani, diluire un campione di sangue appena raccolto in PBS integrato con un EDTA millimolare ad un rapporto uno a uno e strato con cura 20 ml della soluzione ematica su 20 ml di mezzo gradiente di densità per la separazione del gradiente di densità per centrifugazione. Raccogliere lo strato piastrino della cellula mononucleare del sangue medio in un nuovo tubo da 50 ml contenente 40 ml di PBS integrato con EDTA millimolare e portare il volume finale a 50 ml con PBS-EDTA aggiuntivo Dopo il conteggio, isolare i monociti con il kit di isolamento monocito PAN secondo le istruzioni del produttore.
E lavare le cellule tre volte nel mezzo M199 integrato con albumina siere bovina allo 0,5%, o BSA, per eliminare qualsiasi traccia di EDTA. La qualità dell'isolamento dei monociti è fondamentale per garantire un robusto risultato di trasmigrazione e adesione. Pertanto è importante seguire rigorosamente la raccomandazione del produttore per l'isolamento.
Rimescolare il pellet a una concentrazione di 6 volte 10 a 6 monociti per ml in mezzo M199 fresco integrato con 0,5%BSA e dividere le cellule in un'aliquota di 200 microliter per tubo di microcentrifugo per saggio di reclutamento. Quindi posizionare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti prima della loro iniezione nella camera di flusso. Per preparare il sistema fluido per l'analisi, inserire prima un connettore maschio luer in un'estremità di un tubo di silicone lungo 8 cm e 3 mm di spessore e collegare l'altra estremità a un set di iniezione luer in linea.
Quindi collegare il connettore luer a un'estremità di un tubo di silicone lungo 40 cm e spesso 3 mm. Successivamente, la siringa da 20 mm a un'estremità di un tubo di silicone lungo 1 m e lungo 3 mm e inserire un connettore luer maschio all'altra estremità. Quindi inserire entrambi i connettori luer maschi in un accoppiatore di serratura luer femmina e posizionare l'estremità libera del tubo in silicone in un serbatoio di 37 gradi Celsius M199 medium integrato con 0,5%BSA.
Ritrarre lo stantuffo per riempire il tubo con il tampone di flusso e fissare la siringa sulla pompa della siringa. Quindi impostare la pompa sulla modalità di ritiro e specificare la portata. Per collegare la camera di scorrimento, bloccare i tubi in silicone attorno all'accoppiatore di blocco luer femmina e scollegare i due maschi del connettore luer dall'accoppiatore per consentire il collegamento al serbatoio dello scivolo.
Le bolle d'aria non solo disturbano la qualità dell'immagine, ma inducono anche stress capillare alle cellule, portando alla morte cellulare. Per evitare bolle d'aria, confermare il corretto bloccaggio del tubo prima di inserire il luer nel serbatoio. Quindi rimuovere i morsetti per confermare che la connessione non perde e posizionare lo scivolo al microscopio.
Per l'imaging del reclutamento di monociti sotto flusso, aggiungere 5 microlitri di anticorpi anti CD16 coniugati a flourescenza e un colorante nucleare appropriato per ogni monociti aliquoti per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente e raccogliere le cellule con una breve centrifugazione. Resuspend il pellet in 250 microlitri di tampone di flusso e avviare la pompa della siringa. Aggiungere 30 microlitri di una sospensione monocitare a una camera dello scivolo e selezionare l'obiettivo 40X al microscopio confocale.
Attivare i laser fluorescenti appropriati e utilizzare la camera con il monocita etichettato per impostare i parametri di acquisizione del microscopio confocale Next, selezionare tre campi di visualizzazione entro un raggio di mezzo centimetro per l'imaging confocale multi posizione e impostare una pila Z sull'intervallo da 10 a 12 micrometri e l'acquisizione time lapse per l'esecuzione ogni un minuto. Dopo tre minuti di imaging, iniettare 200 microlitri di monociti attraverso la porta di iniezione luer in linea e iniziare a immaginare l'interazione cellulare. Dopo almeno 30 minuti, interrompere l'imaging e il flusso e bloccare il tubo per consentirgli di scollegarlo dallo scivolo.
Per determinare la velocità di trasmigrazione delle cellule attraverso gli HUVEC stimolati, aprire l'immagine J e contare il numero totale di monociti aderenti in ogni campo per determinare il numero di celle per millimetro quadrato. Quindi contare il numero di monociti trasmigrati presenti nel piano basale sotto le cellule endoteliali come identificato dalla presenza di una zona di buco nero attorno al nucleo. Un modo semplice per controllare lo stato di attivazione degli HUVEC dopo la stimolazione è la visualizzazione del loro allungamento sotto stress infiammatorio.
L'imaging confocale time lapse consente la visualizzazione dei monociti sul piano apicale in cui è possibile valutare il loro fenotipo. Le cellule migratrici sottoposte a trasmigrazione si spostano alla giunzione intercellulare da cellula a cellula prima che scompaiano dal piano apicale e ricompargano nel piano basale. La quantificazione del reclutamento di monociti nel tempo conferma che l'adesione dei monociti è seguita dalla trasmigrazione.
Il tasso di trasmigrazione del monocita positivo CD16 è basso quando la cellula endoteliale viene stimolata solo con TNF alfa ma aumenta quando le cellule endoteliali vengono stimolate con fattore di crescita endoteliale alfa e vascolare TNF o VEGFA. La stimolazione HUVEC con TNF alpha e TNF alpha più VEGFA induce un aumento dell'aderenza alle cellule T, B e NK negative CD14, rispetto ai monociti positivi CD14. Inoltre, la stimolazione HUVEC induce la trasmigrazione della sola popolazione di monociti, poiché le cellule T, B e NK non si trasmigrano in condizioni stimolanti TNF alpha o TNF alpha più VEGFA.
Per eseguire un test di reclutamento monocito ottimale, è importante pianificare l'esperimento in anticipo e farlo nello stesso giorno. E quando purificate le cellule, assicuratevi che il microscopio sia a 37 gradi in modo da non trasferire le cellule a temperatura diversa durante l'esperimento. Per imparare questa procedura, tutti i metodi come la profilazione dell'espressione di citochina e chemiochina HUVEC, nonché gli studi sulla chemiotassi possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul meccanismo molecolare che sostiene la trasmigrazione e l'adesione di una specifica popolazione di monociti.
