Pois este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da inflamação e imunologia. Por exemplo, quais são os mecanismos moleculares de adesão leucócito e migração trans-endotelial. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a discriminação de uso ilimitado entre transmigração e forte adição de monócitos à monocamadas endotelial.
Embora este método forneça informações sobre o recrutamento de monócitos no fluxo, ele também pode ser adaptado a outras células dos sistemas hematopoiéticos, como células T, células B ou derivados da subpopulação. Após a lavagem, rotule as células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVEC com 30 microliters de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com um CMFDA micromolar por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Ao final da incubação, lave as células com 150 microliters de meio M199 completo e incuba a cultura em 150 microliters de meio M199 completo fresco por mais 30 minutos.
Em seguida, substitua o supernascer por 150 microliters de meio M199 completo contendo os suplementos experimentais apropriados e devolva a cultura da câmara de slides à incubadora por seis horas. Para o isolamento monócito PAN humano, diluir uma amostra de sangue recém-coletada em PBS suplementada com um EDTA mililitro em uma razão de um para um e cuidadosamente camada 20 ml da solução sanguínea em 20 ml de média gradiente de densidade para separação gradiente de densidade por centrifugação. Colete a camada de plaquetas de células mononucleares de sangue médio em um novo tubo de 50 ml contendo 40 ml de PBS complementado com 1 mililitro EDTA e leve o volume final a 50 ml com PBS-EDTA adicional Após a contagem, isole os monócitos com o kit de isolamento de monócito PAN de acordo com a instrução do fabricante.
E lave as células três vezes em m199 médio suplementado com 0,5% Bovine Serum Albumin, ou BSA, para eliminar quaisquer traços de EDTA. A qualidade do isolamento monócito é fundamental para garantir uma transmigração robusta e resultado de adesão. Assim, é importante seguir rigorosamente a recomendação do fabricante para o isolamento.
Resuspenque a pelota a uma concentração de 6 vezes 10 a 6 monócitos por ml em m199 médio fresco complementado com 0,5% BSA e divida as células em uma alíquota de 200 microliter por tubo de microcentrifuagem por ensaio de recrutamento. Em seguida, coloque as células a 37 graus Celsius por 20 minutos antes de sua injeção na câmara de fluxo. Para preparar o sistema fluido para a análise, insira primeiro um conector luer masculino em uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento e conecte a outra extremidade a um conjunto de injeção de luer inline.
Em seguida, conecte o conector luer a uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento de 40 cm de comprimento. Em seguida, a seringa de 20 mm para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone de 3mm de comprimento e 1 m de espessura e inserir um conector luer masculino para a outra extremidade. Em seguida, insira ambos os conectores luer machos em um acoalador de travas luer fêmea e coloque a extremidade livre da tubulação de silicone em um reservatório de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com 0,5%BSA.
Retire o êmbolo para encher a tubulação com tampão de fluxo e fixe a seringa na bomba de seringa. Em seguida, ajuste a bomba para o modo de retirada e especifique a taxa de fluxo. Para conectar a câmara de slides, fixar a tubulação de silicone ao redor do acotrador de luer feminino e desconectar os dois machos conectores luer do acotraente para permitir que eles sejam conectados ao reservatório do slide.
As bolhas de ar não só perturbam a qualidade da imagem, mas também induzem o estresse capilar às células, levando à morte celular. Para evitar bolhas de ar, confirme a fixação correta da tubulação antes de inserir o luer no reservatório. Em seguida, remova os grampos para confirmar que a conexão não está vazando e coloque o slide sob o microscópio.
Para a imagem do recrutamento de monócitos sob fluxo, adicione 5 microlitadores de farinha conjugada anticorpo anti CD16 e um corante nuclear apropriado a cada monócito aliquoed para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente e colete as células com uma breve centrifugação. Resuspenque a pelota em 250 microliters de tampão de fluxo e inicie a bomba de seringa. Adicione 30 microlitros de uma suspensão monocito a uma câmara do slide e selecione o objetivo de 40X no microscópio confocal.
Ative os lasers fluorescentes apropriados e use a câmara com o monócito rotulado para definir os parâmetros de aquisição do microscópio confocal Next, selecione três campos de visão dentro de um raio de meio centímetro para imagens confocal de posição multi-posição, e defina uma pilha Z para a faixa de 10 a 12 micrômetros e a aquisição de lapso de tempo para ser executada a cada um minuto. Após três minutos de imagem, injete 200 microliters de monócitos através da porta de injeção de luer inline e comece a fotografar a interação celular. Após pelo menos 30 minutos, pare a imagem e o fluxo e aperte a tubulação para permitir que ela seja desconectada do slide.
Para determinar a taxa de transmigração das células através dos HUVECs estimulados, abra a imagem J e conte o número total de monócitos aderentes em cada campo para determinar a contagem de células por milímetro quadrado. Em seguida, conte o número de monócitos transmigrados que estão presentes no plano basal sob as células endoteliais, conforme identificado pela presença de uma zona de buraco negro ao redor do núcleo. Uma maneira simples de verificar o estado de ativação dos HUVECs após a estimulação é visualizar seu alongamento sob estresse inflamatório.
A imagem confocal de lapso de tempo permite a visualização dos monócitos no plano apical onde seu fenótipo pode ser avaliado. As células migratórias submetidas à transmigração movem-se para a junção intercelular célula-celular antes que elas desapareçam do plano apical e reapareçam no plano basal. A quantitação do recrutamento de monócitos ao longo do tempo confirma que a adesão monócito é seguida pela transmigração.
A taxa de transmigração do monócito positivo CD16 é baixa quando a célula endotelial é estimulada apenas com TNF alfa, mas aumenta quando as células endoteliais são estimuladas com fator de crescimento endotelial TNF e vascular ou VEGFA. A estimulação HUVEC com TNF alfa e TNF alfa mais VEGFA induz um aumento na adesão às células T, B e NK negativas cd14, em comparação com monócitos positivos CD14. Além disso, a estimulação huvec induz a transmigração apenas da população monócito, já que as células T, B e NK não transmigram sob as condições estimulatórias TNF alfa ou TNF alpha mais VEGFA.
Para realizar um ótimo ensaio de recrutamento de monócitos, é importante que você planeje seu experimento com antecedência e faça-o no mesmo dia. E quando você purificar as células, certifique-se de que seu microscópio está a 37 graus para que você não transfira as células para uma temperatura diferente durante o experimento. Para aprender esse procedimento, todos os métodos como o perfil da expressão de citocina huvec e quimiocina, bem como estudos de quimiotaxis podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o mecanismo molecular que sustenta a transmigração e a adesão da população específica de monócitos.
