Bu yöntem için inflamasyon ve immünoloji alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir. Örneğin, lökosit adezyonunun moleküler mekanizması ve trans-endotel göçü nelerdir. Bu tekniğin en büyük avantajı, transmigration ve endotel monolayer monositgüçlü eklenmesi arasında sınırsız kullanım ayrımcılık sağlar olmasıdır.
Bu yöntem akış üzerinde monositlerin işe alınması hakkında bilgi sağlasa da, t-hücreleri, B-hücreleri veya bunların alt popülasyontürevleri gibi hematopoetik sistemlerin diğer hücrelerine de adapte edilebilir. Yıkadıktan sonra, 37 derece Santigrat M199 orta 30 mikrolitre ile insan göbek ven endotel hücreleri veya HUVEC etiket bir mikromolar CMFDA ile 37 derece santigrat derece ve% 5 Karbondioksit 10 dakika için takviye. Kuluçka sonunda, hücreleri 150 mikrolitre tam M199 ortasıyla yıkayın ve kültürü 150 mikrolitre taze tam M199 ortamına 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.
Daha sonra supernatant'ı uygun deneysel takviyeleri içeren 150 mikrolitre tam M199 ortamıile değiştirin ve slayt odası kültürünü altı saat boyunca kuvöze geri döndürün. İnsan PAN monosit izolasyonu için, PBS'de taze toplanan bir kan örneğini bire bir oranında bir milimolar EDTA ile takviye edin ve santrifüj ile yoğunluk gradyan ayrımı için 20 ml yoğunluk gradyan ortasına kan çözeltisinin 20 ml'lik kısmını dikkatlice katlayın. 1 milimolar EDTA ile takviye PBS 40 ml içeren yeni bir 50 ml tüp içine orta periferik kan mononükleer hücre trombosit tabakası toplamak ve sayma sonra ek PBS-EDTA ile 50 ml son hacmi getirmek, üreticinin talimatına göre PAN monosit izolasyon kiti ile monosit izole.
Ve EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için, 0.5% Sığır Serum Albumin veya BSA ile desteklenen M199 orta hücreleri üç kez yıkayın. Monosit izolasyonunun kalitesi, sağlam transmigration ve yapışma sonucu sağlamak için çok önemlidir. Bu nedenle, izolasyon için üreticinin tavsiyesini harfiharfine harfimek önemlidir.
Taze M199 orta ml konsantrasyonu başına 6 kez 10 pelet resuspend 0.5% BSA ile desteklenen ve işe alım tsay başına mikrocentrifuge tüp başına bir 200 mikrolitre aliquot hücreleri bölmek. Daha sonra 37 derece santigrat derecede, akış odasına enjekte edilmeden önce 20 dakika yerleştirin. Analiz için akışkan sistemi hazırlamak için, ilk silikon boru 8 cm uzunluğunda 3 mm kalınlığında parça bir ucuna bir erkek luer konektör takın ve bir inline luer enjeksiyon seti diğer ucunu bağlayın.
Daha sonra luer konektörünü 40 cm uzunluğunda 3 mm kalınlığında silikon boru parçasının bir ucuna bağlayın. Daha sonra, 20 mm şırınga 1 m uzunluğunda 3mm kalınlığında silikon boru parçasının bir ucuna ve diğer uca bir erkek luer konektörü yerleştirin. Sonra bir kadın luer kilit bağlayıcı içine her iki erkek luer konektörler takın ve 37 derece Santigrat M199 orta% 0.5 BSA ile desteklenen bir rezervuar içine silikon boru serbest ucunu yerleştirin.
Tüplü havaleyi akış tamponuyla doldurmak için pistonu geri çekin ve şırınga pompasını sabitlayın. Daha sonra pompayı çekme moduna ayarlayın ve akış hızını belirtin. Slayt odası bağlamak için, kadın luer kilit bağlayıcı etrafında silikon boru kelepçe ve onları slayt rezervuar bağlı izin vermek için beyit iki luer konektör erkek kesmek.
Hava kabarcıkları sadece görüntü kalitesini bozmakla kalmıyor, aynı zamanda hücrelere kılcal damar stresini de tetikler ve hücre ölümüne yol açarak ölüme yol açada. Hava kabarcıklarından kaçınmak için, luer'i rezervuara takmadan önce borunun doğru kenetlemesi onaylayın. Ardından bağlantının sızdırmadığını doğrulamak için kelepçeleri çıkarın ve kaydırağı mikroskop un altına yerleştirin.
Akış altında monosit işe görüntüleme için, unescence kontal16 antikor ve oda sıcaklığında 10 dakikalık kuluçka için her aliquoted monositler için uygun bir nükleer boya 5 mikrolitre ekleyin ve kısa bir santrifüj ile hücreleri toplamak. 250 mikrolitre akış tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve şırınga pompasını çalıştırın. Kaydıraktan bir haznesine 30 mikrolitre monosit süspansiyon ekleyin ve konfokal mikroskoptaki 40X hedefini seçin.
Uygun floresan lazerleri etkinleştirin ve konfokal mikroskobun kazanım parametrelerini ayarlamak için etiketli monositli odayı kullanın Sonraki, çoklu konumkonfokal görüntüleme için yarım santimetre yarıçap içinde üç görüş alanı seçin ve 10 ila 12 mikrometre aralığına bir Z destesi ayarlayın ve her dakika çalışması için zaman atlamalı kazanım. Üç dakikalık görüntülemeden sonra, 200 mikrolitre monositi sıralı luer enjeksiyon portundan enjekte edin ve hücresel etkileşimi görüntülemeye başlayın. En az 30 dakika sonra, görüntülemeyi ve akışı durdurun ve kaydıraktan kopmasını sağlamak için tüpü kıskaca alın.
Uyarılmış HUVECs aracılığıyla hücrelerin transmigration oranını belirlemek için, açık görüntü J ve milimetre başına hücre sayısını belirlemek için her alanda yapışık monositlerin toplam sayısını saymak. Daha sonra, çekirdeğin etrafındaki bir kara delik zonunun varlığıyla tanımlanan endotel hücrelerinin altındaki bazal düzlemde bulunan göç etmiş monositlerin sayısını sayın. Stimülasyon dan sonra HUVECs aktivasyon durumunu kontrol etmek için basit bir yolu inflamatuar stres altında uzama görselleştirme etmektir.
Zaman atlamalı konfokal görüntüleme, monositlerin fenotiplerinin değerlendirilebileceği apikal düzlemde görüntülenmelerini sağlar. Transmigration geçiren hücreler, apikal düzlemden kaybolmadan ve bazal düzlemde yeniden ortaya çıkmadan önce hücreler arası hücreden hücreye biraraya taşınırlar. Zaman içinde monosit alımının sayısallaştırılması, monosit adezyonunun transmigration tarafından takip edilebildiğini doğrular.
CD16 pozitif monositin transmigration oranı endotel hücresi sadece TNF alfa ile uyarıldığında düşüktür ancak endotel hücreleri hem TNF alfa hem de vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGFA ile uyarıldığında artar. TNF alfa ve TNF alfa artı VEGFA ile HUVEC stimülasyonu CD14 negatif T, B ve NK hücrelerine bağlılık bir artış neden olur, CD14 pozitif monositler karşılaştırın. Buna ek olarak, HUVEC stimülasyon sadece monosit popülasyonun transmigration neden olur, T, B ve NK hücreleri ya TNF alfa veya TNF alfa artı VEGFA uyarıcı koşulları altında göç yok gibi.
Optimal bir monosit işe alım tayini gerçekleştirmek için, denemenizi önceden planlamanız ve aynı gün yapmanız önemlidir. Hücreleri arındırdığınızda, mikroskobunuzun 37 derecede olduğundan emin olun, böylece deney sırasında hücreleri farklı sıcaklıklara aktarmayın. Bu prosedürü öğrenmek için, HUVEC sitokin ve kemokine ekspresyonu profilleme gibi tüm yöntemlerin yanı sıra kemotaksis çalışmaları transmigration ve belirli monosit popülasyonun transmigration ve yapışma sürdürmek moleküler mekanizma hakkında ek soru cevaplamak için yapılabilir.
