이 방법을 들어 염증 및 면역학 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 백혈구 접착및 트랜스 내피 이동의 분자 기계장치는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 내피 단층층에 트랜스마이그레이션과 모노사이클을 강력하게 추가하는 것 사이의 무제한 사용 차별을 허용한다는 것입니다.
이 방법은 흐름상단핵세포의 모집에 대한 정보를 제공하지만, T세포, B세포 또는 이의 소집단의 유도체와 같은 조혈 시스템의 다른 세포에도 적응될 수 있다. 세척 후 인간 배빌레 정맥 내피 세포 또는 HUVEC에 37도 의 마이크로리터 37도 M199 배지를 37°C의 마이크로몰라 CMFDA로 보충하여 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 10분간 라벨을 부착합니다. 인큐베이션이 끝나면 150마이크로리터의 완전한 M199 배지로 세포를 세척하고 150마이크로리터의 신선한 완전 M199 배지에서 30분 간 배양한다.
그런 다음 상체를 적절한 실험 보충제를 함유한 완전한 M199 배지의 150 마이크로리터로 대체하고 6시간 동안 슬라이드 챔버 배양을 인큐베이터로 반환한다. 인간 PAN 단화 분리의 경우, PBS에서 갓 수집된 혈액 샘플을 1 대 1 비율로 보충하고 20 ml의 혈액 용액을 밀도 그라데이션 배지에 조심스럽게 층으로 희석하여 원심분리에 의한 밀도 그라데이션 분리를 위한 밀도 그라데이션 배지를 사용한다. 중간 말초 혈액 단핵 세포 혈소판을 1 밀리머 EDTA로 보충한 PBS 40ml를 포함하는 새로운 50ml 튜브로 수집하고 계산 후 추가 PBS-EDTA를 사용하여 최종 볼륨을 50ml로 가져와 제조업체의 지시에 따라 PAN 단핵 분리 키트로 단핵구를 분리합니다.
그리고 EDTA의 흔적을 제거하기 위해 0.5%의 소세럼 알부민 또는 BSA로 보충된 M199 배지에서 세포를 세 번 세척한다. 단세포 절연의 품질은 강력한 트랜스마이그레이션 및 접착 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다. 따라서 격리에 대한 제조업체의 권장 사항을 엄격히 따르는 것이 중요합니다.
0.5%BSA로 보충된 신선한 M199 배지에서 ml 농도 당 6개의 단백구에 6회 10회에서 펠릿을 재연하고, 모집 분석당 마이크로센트리슈지 튜브당 200 마이크로리터 알리쿼트1개로 세포를 나눕니다. 그런 다음 유량 챔버에 주입하기 전에 20 분 동안 37도 섭씨에 세포를 놓습니다. 분석을 위한 유체 시스템을 준비하려면 먼저 8cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입하고 다른 쪽 끝을 인라인 루어 주입 세트에 연결합니다.
그런 다음 루어 커넥터를 40cm 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브 조각의 한쪽 끝에 연결합니다. 다음으로, 20mm 주사기는 1m 길이의 3mm 두께의 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 있고 다른 쪽 끝에 수컷 루어 커넥터를 삽입합니다. 그런 다음 두 남성 루어 커넥터를 암컷 루어 잠금 커플러에 삽입하고 실리콘 튜브의 자유 끝을 섭씨 37도 M199 배지의 저수지에 0.5%BSA로 보충합니다.
플런저를 철회하여 튜브를 유동 버퍼로 채우고 주사기 펌프의 주사기를 고정합니다. 그런 다음 펌프를 인출 모드로 설정하고 유량을 지정합니다. 슬라이드 챔버를 연결하려면 여성 루어 잠금 커플러 주위에 실리콘 튜브를 고정하고 커플러에서 두 루어 커넥터 남성을 분리하여 슬라이드의 저장소에 연결할 수 있습니다.
기포는 이미지 품질을 방해할 뿐만 아니라 세포에 모세관 깎아지른 듯한 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유발합니다. 기포를 피하기 위해 루어를 저수지에 삽입하기 전에 튜브의 올바른 클램핑을 확인하십시오. 그런 다음 클램프를 제거하여 연결이 누출되지 않는지 확인하고 슬라이드를 현미경 아래에 배치합니다.
흐름 하에서 단세포 모집의 화상 진찰을 위해, 밀가루 컨쥬게이징 된 안티 CD16 항체의 5 마이크로 리터와 실온에서 10 분 배양에 대한 각 알리인용 단핵 염료를 추가하고 간단한 원심분리로 세포를 수집합니다. 플로우 버퍼의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 주사기 펌프를 시작합니다. 슬라이드의 한 챔버에 하나의 단핵 현탁액 30 마이크로 리터를 추가하고 공초점 현미경에 40X 목표를 선택합니다.
적절한 형광 레이저를 활성화하고 표지된 단세포로 챔버를 사용하여 공초점 현미경의 획득 매개 변수를 설정하고, 다중 위치 공초점 이미징을 위해 반센티미터 반경 반반 내에 3개의 시야필드를 선택하고, Z 스택을 10~12마이크로미터 범위로 설정하고 시간 경과 획득을 1분마다 실행한다. 3분간의 이미징 후 인라인 루어 주입 포트를 통해 200마이크로리터의 단핵구를 주입하고 세포 상호 작용을 이미징하기 시작합니다. 적어도 30분 후에는 이미징과 흐름을 중지하고 튜브를 고정하여 슬라이드에서 분리할 수 있습니다.
자극된 HUVECs를 통해 세포의 환원 율을 결정하기 위해, 이미지 J를 열고 각 분야에서 부착 된 단핵구의 총 수를 계산하여 평방 밀리미터당 셀 수를 결정합니다. 그런 다음 핵 주위의 블랙홀 영역의 존재에 의해 확인된 내피 세포 아래 기저 평면에 존재하는 변환된 단핵구의 수를 계산한다. 자극 후 HUVECs의 활성화 상태를 확인하는 간단한 방법은 염증 성 스트레스하에서 신장을 시각화하는 것입니다.
시간 경과 공초점 이미징은 표현형을 평가할 수 있는 정평 평면에서 단핵구를 시각화할 수 있습니다. 이동 을 겪고 있는 이동 세포는 세포 간 세포-세포-세포 접합으로 이동한 후 정문 평면에서 사라지고 기저 평면에 다시 나타납니다. 시간이 지남에 따라 단세포 모집의 수량은 단일 세포 접착이 트랜스 마이그레이션 다음에 있음을 확인합니다.
CD16 양성 단핵구의 환원율은 내피 세포가 TNF 알파로만 자극될 때 낮지만 내피 세포가 TNF 알파 및 혈관 내피 성장 인자 또는 VEGFA로 자극될 때 증가한다. TNF 알파 및 TNF 알파 플러스 VEGFA를 통한 HUVEC 자극은 CD14 음의 T, B 및 NK 세포에 대한 준수의 증가를 유도하며, CD14 양성 단핵구와 비교한다. 또한, HUVEC 자극은 T, B 및 NK 세포가 TNF 알파 또는 TNF 알파 플러스 VEGFA 자극 조건 하에서 마이그레이션하지 않기 때문에 단세포 집단의 환전을 유도한다.
최적의 단세포 채용 분석서를 수행하려면 실험을 미리 계획하고 같은 날에 수행하는 것이 중요합니다. 그리고 세포를 정화할 때 현미경이 37도에 있는지 확인하여 실험 중에 세포를 다른 온도로 옮기지 않도록하십시오. 이 절차를 배우기 위하여는, HUVEC 사이토카인및 chemokine 발현의 프로파일링 과 같은 모든 방법 뿐 아니라 화학요법 연구 결과는 특정 단세포 집단의 환원 및 접착을 유지하는 분자 기계장치에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.
