この方法により、コアヒストンH3とH4の正確な定量化と、細胞および組織抽出物からの翻訳後の改変が可能になり、高品質で再現性の高い結果が生成されます。提示された技術には、3つの主な利点があります。まず、ヒストンの翻訳後のネイティブ変更を保存します。
第二に、それは高価な低スループットの方法をバイパスします。最後に、ダウンストリームの中程度のスループット アプリケーションと完全に互換性があります。この手順を実証するのは、このプロトコルを完全に最適化し、アルツハイマー病のエピジェネティックな調節に関する重要な質問に答える技術を採用した私の研究室の有能な大学院生であるカロリーナ・ヤンチュラです。
10センチメートルの組織で細胞を培養処理した皿を、テキストプロトコルに従って適切な細胞培養培地でプレートする。彼らは約90%の合流に達するまで細胞が成長することを許可します。細胞が所望の合流度に達した後、培養培地を穏やかに吸引し、細胞を前温め無血清培地で2回洗浄する。
この後、細胞から無血清培地を取り出し、10センチメートルの皿を氷の上に置きます。各皿に氷冷抽出バッファーの1ミリリットルを追加します。プラスチックセルスクレーパーを使用して、抽出バッファー内の細胞を収集し、ラベル付き1.5ミリリットルチューブに転送します。
その後、氷の上にチューブを置きます。凍結組織を使用する場合は、あらかじめ冷やされた1.5ミリリットルのチューブに組織を入れ、氷の上で短時間解凍します。次に、推奨される抽出バッファー量とストローク数を使用して、ハンドヘルドホモジナイザーで脳組織を均質化します。
均質化は、目に見える組織断片がなく、溶液が乳白色の外観を取る場合に完了します。この後、シングルチャンネル1,000マイクロリットルピペットを使用してホモジネートをあらかじめ冷蔵された1.5ミリリットルチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。細胞のライセートと均質化された脳組織を含むチューブを、摂氏4度で15 RPMで回転する回転プラットフォームに置きます。
この後、最高速度でチューブを摂氏4度で10分間遠心します。次に上清を新しい冷蔵1.5ミリリットルチューブに移し、ペレットを捨てます。次に、1/4ボリュームの中和バッファーでヒストンを中和し、上下にピペットで混ぜます。
pHストリップを使用して混合物のpHを確認し、必要に応じて中和バッファーでpHをさらに調整します。酸性ヒストンがこの工程中に中和されない場合、それらはカラム膜に適切に結合せず、それを通過し、フロースルーで検出されます。サンプルバッファーを12.5マイクロリットルに37.5マイクロリットル加えます。
短い遠心分離の後、10分間摂氏99度で混合物を変性させる。この後、氷の上にチューブを置き、凝縮物を収集するためにそれらを短時間回転させます。サンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、100ボルトで1時間動かします。
その後、ゲルを一晩汚します。そして、3回連続の打ち上げ中にそれをデステイン。まず、各スピンカラムに500マイクロリットルの平衡バッファーを追加します。
柱を3分間遠心分離します。フロースルーを破棄し、遠心分離をもう一度繰り返します。この後、500マイクロリットルのサンプルをカラムに加えます。
柱を3分間遠心し、フロースルーを収集します。次に、前述のように列フロースルーを分析します。500マイクロリットルの洗浄バッファーをカラムに加えます。
柱を3分間遠心し、フロースルーを収集します。列を新しいラベル付きの 1.5 ミリリットルチューブに移します。50マイクロリットルのヒストン溶出バッファーをカラムに加えます。
遠心後カラムはヒストンタンパク質を含むフロースルーを保存します。化学フードの下で4%の過塩素酸の最終的な濃度を達成するために精製されたヒストンに過塩素酸を加えます。ピペットは6回上下して混ぜ合わせます。
サンプル中のヒストンが非常に濃縮されている場合、過塩素酸を添加した後、溶液が濁ります。この後、24時間摂氏4度でチューブをインキュベートします。一晩ヒストン沈殿が成功した場合、遠心分離工程後にバイアルの底に小さな白いペレットが見える。
連続したステップでペレットを洗浄する場合、ペレットはバイアル底部から容易に取り外すことができるので、邪魔されないことを保証する。翌日、予冷したマイクロ遠心チューブでサンプルを75分間遠心します。上清を慎重に吸引し、ペレットサンプルに500マイクロリットルの氷冷過塩素酸を加えます。
試料を最高速度で10分間遠心した後、上清を吸引する。ペレットを乱さないよう、サンプルに500マイクロリットルの氷冷アセトンを加えます。次に上清を取り除き、チューブを氷の上で30分間乾燥させます。
その後、氷からチューブを取り出し、サンプルを室温で5分間乾燥させます。ペレットを乾燥後、30マイクロリットルの無菌水で再懸濁する。チューブをキャップし、ヒストンが氷の上で30〜50分間再構成できるようにします。
ペレットが再懸濁されていることを確認した後、チューブを再キャップし、氷から取り除く。本プロトコルではヒトミクログリアBV-2細胞からのヒストンを精製し、抽出組成物を分析した。染色されたゲルは、15分から24時間の間の抽出時間が粗ヒストン抽出物の全体的な組成に影響を及ぼさなかったことを示す。
カラムのマトリックスへのヒストン結合の効率を、ゲルの染色を介して分析した。カラムのフロースルーに検出可能なヒストンタンパク質がないことで証明されるようにカラム効率は約100%であった。抽出時間に関係なく、すなわち。
15分、2時間または24時間。最初のカラム洗浄は、抽出物から非ヒストンタンパク質の最大量を排除します。24時間抽出群から精製ヒストンタンパク質画分は、15分および2時間の抽出時間と比較してより多くのH3およびH4ヒストンを含んでいた。
第1カラム溶出は、2番目の溶出物中のヒストンタンパク質の欠如によって証明されるように約100%効率的であった。その後、マウスの脳全体から粗いヒストンを抽出し、翻訳後の修飾を測定した。広く作用するHADC阻害剤に応答して、トリブトリリン、H4K12アセチル化は抽出物において増加した。
しかし、粗抽出物中の不純物の存在により抗体の特異性が低下した。ヒストン精製プロトコルは、クラスIおよびIIb HDAC阻害剤M344で処理されたトリプルトランスジェニックA/Dマウスの前頭前野を用いて完成し、単一の純粋なコアヒストン分率はH4K12アセチル化の変化について評価した。M344に応答して、総ヒストンが検出され、H4K12アセチル化の有意な増加が観察された。
この手順を試みる間、プロセス全体にわたって成功したヒストン精製を検証するために、プロトコル内で説明されている複数のチェックポイントを実行することを忘れないでください。この手順に従って、ヒストンリン酸化およびメチル化状態に関する追加の質問に対処することができる。この技術の開発は、アルツハイマー病に関与する遺伝的メカニズムを分析するために私たちの研究室の研究者のための道を開きました。
しかし、クロマチン修飾が重要な役割を果たすと仮定される様々な疾患モデルに使用することができる。
