Diese Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Kernhistonen H3 und H4 und deren posttranslationalen Modifikationen aus Zell- und Gewebeextrakten, die somit zur Erzeugung hochwertiger, reproduzierbarer Ergebnisse führen. Die vorgestellte Technik hat drei Hauptvorteile. Erstens bewahrt es native post-translationale Modifikationen von Histonen.
Zweitens umgeht sie teure Niedrigdurchsatzmethoden. Schließlich ist es vollständig kompatibel mit nachgeschalteten Anwendungen mit mittlerem Durchsatz. Demonstriert wird das Verfahren karolina Janczura eine talentierte Studentin aus meinem Labor, die dieses Protokoll vollständig optimiert und die Technik verwendet, um wichtige Fragen zur epigenetischen Regulation bei Alzheimer zu beantworten.
Um die Zellen in 10-Zentimeter-Gewebekultur-behandelten Gerichten mit den entsprechenden Zellkulturmedien nach dem Textprotokoll zu verzieren. Lassen Sie die Zellen wachsen, bis sie etwa 90% Konfluenz erreichen. Nachdem die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, saugen Sie die Kulturmedien sanft an und waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmten serumfreien Medien.
Danach die serumfreien Medien aus den Zellen entfernen und die 10-Zentimeter-Gerichte auf Eis legen. Fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter eiskalten Extraktionspuffer hinzu. Mit einem Kunststoffzellenschaber sammeln Sie die Zellen im Extraktionspuffer und übertragen sie in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr.
Dann legen Sie die Rohre auf Eis. Wenn gefrorenes Gewebe verwendet wird, legen Sie das Gewebe in eine vorgekühlte 1,5-Milliliter-Röhre und tauen Sie es kurz auf Eis auf. Als nächstes homogenisieren Sie das Gehirngewebe mit einem Handhomogenisator mit der empfohlenen Menge an Extraktionspuffer und Anzahl der Striche.
Die Homogenisierung ist abgeschlossen, wenn keine sichtbaren Gewebefragmente vorhanden sind und die Lösung ein milchiges Aussehen annimmt. Danach verwenden Sie eine einkanalige 1.000-Mikroliter-Pipette, um das Homogenat in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen und die Rohre auf Eis zu legen. Platzieren Sie das Rohr mit den Zelllysaten und homogenisiertem Hirngewebe auf einer rotierenden Plattform, die sich bei 15 RpM bei vier Grad Celsius dreht.
Danach zentrieren Sie das Rohr mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes den Überstand auf ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr übertragen und das Pellet entsorgen. Als nächstes neutralisieren Sie die Histone mit einem 1/4 Volumen neutralisationspuffer, und mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.
Verwenden Sie pH-Streifen, um den pH-Wert der Mischung zu überprüfen, und passen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit neutralem Neutralisationspuffer weiter an. Wenn saure Histone während dieses Schritts nicht neutralisiert werden, binden sie sich nicht richtig an die Säulenmembran, passieren sie und werden im Durchfluss erkannt. Fügen Sie 37,5 Mikroliter der Probe zu 12,5 Mikroliter Probenpuffer hinzu.
Nach einer kurzen Zentrifugation denaturieren die Mischung bei 99 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach die Rohre auf Eis legen und kurz drehen, um Kondensat zu sammeln. Die Probe auf ein SDS-PAGE-Gel laden und das Gel eine Stunde lang mit 100 Volt ausführen.
Dann färben Sie das Gel über Nacht. Und entzähnen Sie es während drei aufeinanderfolgenden Wähungen. Fügen Sie zunächst 500 Mikroliter Ausgleichspuffer zu jeder Spinspalte hinzu.
Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal. Danach fügen Sie 500 Mikroliter der Probe in die Spalte.
Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten und sammeln Sie den Durchfluss. Analysieren Sie dann den Spaltendurchfluss wie zuvor beschrieben. Fügen Sie der Säule 500 Mikroliter Waschpuffer hinzu.
Zentrifugieren Sie die Säule für drei Minuten und sammeln Sie den Durchfluss. Übertragen Sie die Säule in ein neues beschriftetes 1,5-Milliliter-Rohr. Fügen Sie der Spalte 50 Mikroliter Histon-Elutionspuffer hinzu.
Nach dem Zentrieren der Säule speichern Sie den durchfließenden Histonprotein. Unter einer chemischen Haube perchlorsäure zu den gereinigten Histonen hinzufügen, um eine Endkonzentration von 4% Perchlorsäure zu erreichen. Pipette auf und ab sechs Mal zu mischen.
Wenn die Histonen in der Probe sehr konzentriert sind, wird die Lösung nach zugabe von Perchlorsäure trübe. Danach, inkubieren Sie die Röhre bei vier Grad Celsius für 24 Stunden. Wenn der über Nacht Histon-Niederschlag erfolgreich ist, wird ein kleines weißes Pellet auf der Unterseite der Durchstechflasche nach dem Zentrifugationsschritt sichtbar sein.
Beim Waschen des Pellets in den aufeinanderfolgenden Schritten stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht gestört wird, da es sich leicht vom Durchstechflascheboden lösen kann. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben für 75 Minuten in vorgekühlten Mikrozentrifugenröhren. Den Überstand vorsichtig ansaugen und 500 Mikroliter eiskalte Perchlorsäure in die pelletierte Probe geben.
Nach dem Zentrieren der Probe für 10 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit, aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie der Probe 500 Mikroliter eiskaltes Aceton hinzu und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Als nächstes entfernen Sie den Überstand und lassen Sie die Rohre auf Eis für 30 Minuten unbedeckt trocknen.
Dann entfernen Sie die Rohre vom Eis und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für fünf Minuten trocknen. Nachdem das Pellet trocken ist, wird es in 30 Mikroliter sterilem Wasser wieder ausgesetzt. Kappen Sie die Rohre und lassen Sie die Histone 30 bis 50 Minuten auf Eis rekonstruieren.
Nachdem Sie überprüft haben, ob das Pellet resuspendiert ist, die Rohre zurückstellen und vom Eis entfernen. In diesem Protokoll wurden Histone aus menschlichen mikrogliaalen BV-2-Zellen gereinigt und die Extraktzusammensetzung analysiert. Das gefärbte Gel zeigt, dass Extraktionszeiten zwischen 15 Minuten und 24 Stunden die Gesamtzusammensetzung der rohen Histonextrakte nicht beeinflussten.
Die Wirksamkeit der Histonbindung an die Matrix der Säule wurde durch Färbung des Gels analysiert. Die Koloneffizienz betrug etwa 100%, wie das Fehlen nachweisbarer Histonproteine im Spaltendurchfluss zeigt. Unabhängig von der Extraktionszeitdauer, d.h.
15 Minuten, zwei Stunden oder 24 Stunden. Die erste Säulenwäsche eliminiert die größte Menge an nicht-histonen proteinen aus dem Extrakt. Die gereinigten Histonproteinfraktionen aus der 24-Stunden-Extraktionsgruppe enthielten mehr H3- und H4-Histone im Vergleich zu 15-Minuten- und zweistündigen Extraktionszeiten.
Die erste Kolonnenelution war etwa 100% effizient, wie der Mangel an Histonproteinen im zweiten Eluat belegt. Rohe Histone wurden dann aus dem ganzen Maushirn extrahiert und posttranslationale Modifikationen wurden gemessen. Als Reaktion auf den breit wirkenden HADC-Hemmer erhöhte sich Tributyrin, H4K12-Acetylierung im Extrakt.
Die Spezifität des Antikörpers verringerte sich jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen im Rohextrakt. Das Histonreinigungsprotokoll wurde mit dem präfrontalen Kortex von dreifach transgenen A/D-Mäusen abgeschlossen, die mit dem HDAC-Inhibitor der Klasse I und IIb, M344, behandelt wurden, und die einzelne reine Kern-Histonfraktion wurde auf Veränderungen der H4K12-Acetylierung untersucht. Als Reaktion auf M344 wurde eine signifikante Zunahme der H4K12-Acetylierung festgestellt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die im Protokoll beschriebenen mehreren Prüfpunkte auszuführen, um die erfolgreiche Histonreinigung während des gesamten Prozesses zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Fragen zur Histonphosphorylierung und zum Methylierungsstatus behandelt werden. Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für Forscher in unserem Labor, um die genetischen Mechanismen der Alzheimer-Krankheit zu analysieren.
Jedoch kann es in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen verwendet werden, wo Chromatin-Modifikation wird vermutet, um eine bedeutende Rolle zu spielen.
