Este método permite quantificação precisa das histonas centrais H3 e H4 e suas modificações pós-translacionais de extratos celulares e tecidos, consequentemente levando à geração de resultados reprodutíveis de alta qualidade. A técnica apresentada tem três principais vantagens. Primeiro, preserva modificações pós-translacionais nativas de histones.
Em segundo lugar, ele ignora métodos caros de baixo rendimento. Finalmente, é totalmente compatível com aplicações de média-produção a jusante. Demonstrando o procedimento será Karolina Janczura uma talentosa estudante de pós-graduação do meu laboratório que otimizou totalmente esse protocolo e empregou a técnica para responder a questões importantes sobre a regulação epigenética na doença de Alzheimer.
Para começar a emplacar as células em pratos tratados com cultura de tecido de 10 centímetros com a mídia de cultura celular apropriada de acordo com o protocolo de texto. Permita que as células cresçam até atingirem cerca de 90% de confluência. Depois que as células atingirem a confluência desejada aspiram suavemente os meios de cultura e lavam as células duas vezes com mídia pré-armada sem soro.
Depois disso, remova a mídia sem soro das células e coloque os pratos de 10 centímetros no gelo. Adicione um mililitro de tampão de extração gelada a cada prato. Usando um raspador de células plásticas, colete as células no tampão de extração e transfira-as para um tubo de 1,5 mililitro rotulado.
Em seguida, coloque os tubos no gelo. Se for usado tecido congelado, coloque o tecido em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro e descongele-o brevemente no gelo. Em seguida, homogeneize o tecido cerebral com um homogeneizador portátil usando a quantidade recomendada de tampão de extração e número de derrames.
A homogeneização é completa quando não há fragmentos de tecido visíveis e a solução assume uma aparência leitosa. Depois disso, use uma pipeta de 1.000 microliter de canal único para transferir o homogeneizado para um tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro e coloque os tubos no gelo. Coloque o tubo contendo os lises celulares e o tecido cerebral homogeneizado em uma plataforma rotativa girando a 15 RPMs a quatro graus Celsius.
Depois disso, centrifufique o tubo em velocidade máxima por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o supernasal para um novo tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro e descarte a pelota. Em seguida, neutralize os histones com um volume de 1/4 de tampão de neutralização, e misture por pipetação para cima e para baixo.
Use tiras de pH para verificar o pH da mistura e ajuste ainda mais o pH com tampão de neutralização, se necessário. Se as histonas ácidas não forem neutralizadas durante esta etapa, elas não se ligarão adequadamente à membrana da coluna, passarão por ela e serão detectadas no fluxo. Adicione 37,5 microliters da amostra a 12,5 microliters de tampão amostral.
Após uma breve centrifugação desnaturação a mistura a 99 graus Celsius por 10 minutos. Depois disso, coloque os tubos no gelo e gire-os brevemente para coletar condensado. Carregue a amostra em um gel SDS-PAGE e execute o gel a 100 volts por uma hora.
Então manche o gel durante a noite. E destain-lo durante três lavagens consecutivas. Primeiro adicione 500 microliters de tampão de equilíbrio a cada coluna de spin.
Centrifugar a coluna por três minutos. Descarte o fluxo e repita a centrifugação mais uma vez. Depois disso, adicione 500 microliters da amostra à coluna.
Centrifugar a coluna por três minutos e coletar o fluxo. Em seguida, analise o fluxo da coluna como descrito anteriormente. Adicione 500 microliters de tampão de lavagem à coluna.
Centrifugar a coluna por três minutos e coletar o fluxo. Transfira a coluna para um novo tubo de 1,5 mililitro rotulado. Adicione 50 microliters de tampão de elução de histona à coluna.
Depois de centrifugar a coluna, salve o fluxo contendo proteínas histonas. Sob uma capa química adicione ácido polemóico às histonas purificadas para alcançar uma concentração final de ácido per polemérico de 4%. Pipeta para cima e para baixo seis vezes para misturar.
Se as histonas na amostra estiverem muito concentradas, a solução ficará nublada após a adição de ácido polemóico. Depois disso, incubar o tubo a quatro graus Celsius por 24 horas. Se a precipitação de histona durante a noite for bem sucedida, uma pequena pelota branca será visível na parte inferior do frasco após a etapa de centrifugação.
Ao lavar a pelota nas etapas consecutivas, certifique-se de que a pelota não seja perturbada, pois pode facilmente se desprender do fundo do frasco. No dia seguinte, centrifufique as amostras por 75 minutos em tubos de microcentrifuuge pré-refrigerados. Aspire cuidadosamente o supernascer e adicione 500 microliters ácido polerílico gelado à amostra pelleted.
Depois de centrifugar a amostra por 10 minutos em velocidade máxima, aspire o supernasce. Adicione 500 microliters de acetona gelada à amostra tomando cuidado para não perturbar a pelota. Em seguida, remova o supernasal e deixe os tubos secarem sem tampa no gelo por 30 minutos.
Em seguida, remova os tubos do gelo e deixe a amostra secar à temperatura ambiente por cinco minutos. Depois que a pelota estiver seca, resuspenque-a em 30 microliters de água estéril. Tampe os tubos e deixe as histonas se reconstituírem no gelo por 30 a 50 minutos.
Depois de verificar se a pelota está resuspended, recapitulando os tubos e removê-los do gelo. Neste protocolo, foram purificadas as histonas das células BV-2 humanas microglial e a composição do extrato. O gel manchado demonstra que os tempos de extração entre 15 minutos e 24 horas não afetaram a composição geral dos extratos de histona bruta.
A eficiência da histona vinculando-se à matriz da coluna foi analisada através da coloração do gel. A eficiência da coluna foi de aproximadamente 100%, evidenciada pela ausência de proteínas histonas detectáveis no fluxo da coluna. Independentemente da duração do tempo de extração, ou seja.
15 minutos, duas ou 24 horas. a lavagem da primeira coluna elimina a maior quantidade de proteínas não histonas do extrato. As frações purificadas de proteína histona do grupo de extração de 24 horas continham mais histonas H3 e H4 quando comparadas com os tempos de extração de 15 minutos e duas horas.
A elução da primeira coluna foi aproximadamente 100% eficiente, como evidenciado pela falta de proteínas histonas no segundo eluato. Histonas brutas foram então extraídas de cérebro de rato inteiro e modificações pós-translacionais foram medidas. Em resposta ao inibidor hadc de ação ampla, tributyrin, acetilação H4K12 aumentou no extrato.
No entanto, a especificidade do anticorpo diminuiu devido à presença de impurezas no extrato bruto. O protocolo de purificação de histona foi concluído com o córtex pré-frontal de camundongos transgênicos triplos tratados com o inibidor de HDAC classe I e IIb, M344, e a fração de histona de núcleo puro foi avaliada para alterações na acetilação H4K12. As histonas totais foram detectadas e observou-se um aumento significativo da acetilação H4K12 em resposta ao M344.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar os vários pontos de verificação descritos dentro do protocolo para validar a purificação de histona bem sucedida durante todo o processo. Após este procedimento, podem ser abordadas perguntas adicionais sobre fosforilação de histona e estado de metilação. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para pesquisadores em nosso laboratório analisarem os mecanismos genéticos envolvidos na doença de Alzheimer.
No entanto, pode ser usado em uma variedade de modelos de doenças onde a modificação da cromatina é hipótese para desempenhar um papel significativo.
