Этот метод позволяет точно оценить основные гистоны H3 и H4 и их пост-трансляционные модификации из клеточных и тканевых экстрактов, что, следовательно, приводит к генерации высококачественных, воспроизводимых результатов. Представленная техника имеет три основных преимущества. Во-первых, он сохраняет родные пост-трансляционные модификации гистонов.
Во-вторых, он обходит дорогие методы низкой пропускной способности. Наконец, он полностью совместим с приложениями средней пропускной способности ниже по течению. Демонстрация процедуры будет Каролина Janczura талантливый аспирант из моей лаборатории, который полностью оптимизировал этот протокол и использовал технику, чтобы ответить на важные вопросы, касающиеся эпигенетической регуляции в болезни Альцгеймера.
Для того чтобы начать плиту клетки в 10-сантиметровой ткани культур-обработанные тарелки с соотвествуя средствами культуры клетки согласно протоколу текста. Позвольте клеткам расти, пока они не достигнут около 90% слияния. После того, как клетки достигли желаемого слияния, аккуратно аспирировать культурные средства массовой информации и мыть клетки дважды с довоенной сыворотки свободных средств массовой информации.
После этого удалите из клеток безысовую сыворотку и поместите 10-сантиметровую посуду на лед. Добавьте один миллилитр ледяного буфера экстракции к каждому блюду. С помощью пластикового скребка ячейки собирают клетки в буфере извлечения и передают их в помеченную 1,5-миллилитровую трубку.
Затем поместите трубки на лед. При использовании замороженной ткани поместите ткань в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку и ненадолго оттаивать ее на льду. Далее гомогенизируйте ткани мозга с помощью портативного гомогенизатора, используя рекомендуемое количество буфера экстракции и количество ударов.
Гомогенизация завершена, когда нет видимых фрагментов тканей и раствор приобретает молочный вид. После этого используйте одноканайную трубочку 1000-микролитров для переноса гомогената в предварительно охлажденную трубку 1,5 миллилитров и поместите трубки на лед. Поместите трубку, содержащую лизаты клетки и гомогенизированную ткань мозга, на вращающейся платформе, вращающейся при 15 РДМ при четырех градусах Цельсия.
После этого центрифуга трубки на максимальной скорости в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку и отбросьте гранулы. Затем нейтрализуйте гистоны с 1/4 томом буфера нейтрализации и смешайте с помощью трубок вверх и вниз.
Используйте полосы рН, чтобы проверить рН смеси, и далее настроить рН с буфером нейтрализации, если это необходимо. Если кислотные гистоны не нейтрализованы во время этого шага, они не будут связываться с мембраной столбца должным образом, пройдут через нее и будут обнаружены в пролете. Добавьте 37,5 микролитров образца в 12,5 микролитров буфера выборки.
После краткой центрифугации денатурации смесь при 99 градусах Цельсия в течение 10 минут. После этого поместите трубки на лед и спина их кратко собирать конденсат. Загрузите образец на гель SDS-PAGE и запустите гель на 100 вольт в течение одного часа.
Затем испачкать гель на ночь. И destain его в течение трех последовательных моет. Сначала добавьте 500 микролитров буфера эквилибрации к каждому столбецу спина.
Центрифуга колонны в течение трех минут. Откажитесь от сквозного потока и повторите центрифугу еще раз. После этого добавьте в столбец 500 микролитров образца.
Центрифуга колонны в течение трех минут и собирать поток через. Затем проанализируйте поток столбца, как описано ранее. Добавьте в столбец 500 микролитров буфера стирки.
Центрифуга колонны в течение трех минут и собирать поток через. Перенесите столбец на новую помеченную 1,5-миллилитровую трубку. Добавьте в столбец 50 микролитров буфера гистона elution.
После центрифугирования столбец спасает поток, содержащий гистоновые белки. Под химическим капюшоном добавить перхлорную кислоту в очищенные гистоны для достижения окончательной концентрации 4%перхлорной кислоты. Pipette вверх и вниз шесть раз, чтобы смешать.
Если гистоны в образце очень сконцентрированы, раствор станет облачным после добавления перхлорной кислоты. После этого инкубировать трубку при четырех градусах по Цельсию в течение 24 часов. Если ночь гистон осадков успешно, небольшой белый гранулы будут видны на дне флакона после шага центрифугации.
При мытье гранулы в последовательных шагов заверить гранулы не нарушается, как он может легко отделиться от флакона дна. На следующий день центрифуга образцов в течение 75 минут в предварительно охлажденных микроцентрифуг труб. Тщательно аспирировать супернатант и добавить 500 микролитров ледяной перхлорной кислоты в гранулированный образец.
После центрифугирования образца в течение 10 минут на максимальной скорости, аспирировать супернатант. Добавьте 500 микролитров ледяного ацетона в образец, чтобы не беспокоить гранулы. Затем удалите супернатант и дайте трубам высохнуть незакрытые на льду в течение 30 минут.
Затем снимите трубки со льда и дайте образцу высохнуть при комнатной температуре в течение пяти минут. После того, как гранулы высохнет повторно его в 30 микролитров стерильной воды. Крышка труб и позволяют гистоны восстановить на льду в течение 30 до 50 минут.
Проверив, что гранулы перерасходуются, повторите трубки и удалите их со льда. В этом протоколе были очищены гистоны из человеческих микроглиальных клеток BV-2 и проанализирован состав экстракта. Окрашенный гель показывает, что время извлечения от 15 минут до 24 часов не повлияло на общий состав экстрактов сырого гистона.
Эффективность связывания гистона с матрицей колонны была проанализирована с помощью окрашивания геля. Эффективность колонки была примерно на 100%, о чем свидетельствует отсутствие обнаруживаемых белков гистона в сквозной колонке. Независимо от продолжительности времени извлечения, т.е.
15 минут, два часа или 24 часа. первый столбец мыть устраняет наибольшее количество неистоновых белков из экстракта. Очищенные фракции белка гистона из 24-часовой группы экстракции содержали больше Г3 и H4 гистонов по сравнению с 15-минутным и двухчасовым временем экстракции.
В первой колонке elution был примерно 100%эффективным, о чем свидетельствует отсутствие гистона белков во втором элуат. Затем из всего мозга мыши были извлечены сырые гистоны, и были измерены пост-трансляционные модификации. В ответ на широко действующий ингибитор HADC, трибутирин, ацетилирование H4K12 увеличилось в экстракте.
Однако специфичность антитела снизилась из-за наличия примесей в сыром экстракте. Протокол очистки гистон был завершен с префронтальной коры тройной трансгенной A / D мышей, обработанных с классом I и IIb HDAC ингибитор, M344, и одно чистое ядро гистон фракция была оценена для изменений в H4K12 ацетилирования. Всего гистоны были обнаружены и значительное увеличение Ацетилирования H4K12 наблюдалось в ответ на M344.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы выполнить несколько контрольно-пропускных пунктов, описанных в протоколе для проверки успешной очистки гистон на протяжении всего процесса. После этой процедуры могут быть решены дополнительные вопросы, касающиеся фосфорилирования гистона и состояния метилирования. Разработка этого метода проложила путь для исследователей в нашей лаборатории для анализа генетических механизмов, участвующих в болезни Альцгеймера.
Однако он может быть использован в различных моделях заболеваний, где хроматин модификации предполагается играть значительную роль.
