Bu yöntem, h3 ve H4 çekirdek histones ve hücre ve doku ekstrelerinden post-çevirideğişiklikler böylece yüksek kaliteli, tekrarlanabilir sonuçlar üretimine yol açan kesin nicelik sağlar. Sunulan tekniğin üç ana avantajı vardır. İlk olarak, histones yerli post-çeviri değişiklikler korur.
İkinci olarak, pahalı düşük iş aktarAn yöntemleri atlar. Son olarak, akış aşağı orta iş akışı uygulamaları ile tam uyumludur. Prosedürü gösteren Karolina Janczura tam olarak bu protokolü optimize ve Alzheimer hastalığında epigenetik düzenleme ile ilgili önemli soruları cevaplamak için tekniği istihdam benim laboratuvar yetenekli bir lisansüstü öğrenci olacaktır.
Metin protokolüne göre 10 santimetrelik doku kültürü ile tedavi edilen tabaklarda hücreleri uygun hücre kültürü ortamı ile plakaya başlamak için. Hücrelerin %90'a ulaşana kadar büyümesine izin verin. Hücreler istenilen birleşimi bulduktan sonra kültür ortamını nazikçe aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış serumsuz ortamla iki kez yıkayın.
Bundan sonra, hücrelerden serumsuz ortamı çıkarın ve 10 santimetrelik tabakları buza yerleştirin. Her çanağa bir mililitre buz gibi çıkarma tamponu ekleyin. Plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak ekstraksiyon tampon hücreleri toplamak ve etiketli 1.5 mililitrelik tüp aktarın.
Sonra tüpleri buza yerleştirin. Dondurulmuş doku kullanılırsa, önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir tüp içine doku yerleştirin ve kısaca buz üzerinde eritin. Sonraki ekstraksiyon tampon ve vuruş sayısı önerilen miktarda kullanarak bir el homogenizer ile beyin dokusu homojenize.
Homojenizasyon, görünür doku parçaları olmadığında tamamlanır ve çözelti sütlü bir görünüm emz. Bundan sonra, homojeni önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak ve tüpleri buzüzerine yerleştirmek için tek kanallı 1, 000 mikrolitrelik pipet kullanın. Hücre lisatları ve homojenize beyin dokusuiçeren tüpü, 15 RıF'da dört santigrat derecede dönen dönen bir platforma yerleştirin.
Bundan sonra, dört santigrat derece 10 dakika maksimum hızda tüp santrifüj. Sonraki yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik tüp için supernatant transfer ve pelet atın. Daha sonra histones nötralizasyon tampon hacmi ile nötralize ve yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın nötralize.
Karışımın pH'ını kontrol etmek için pH şeritlerini kullanın ve gerekirse pH'ı nötralizasyon arabelleği yle daha da ayarlayın. Bu adımda asidik histones nötralize edilmezse, onlar düzgün sütun membrana bağlamak olmaz, içinden geçecek ve akış içinde tespit edilecektir. Numune tamponunun 12,5 mikrolitresine numunenin 37,5 mikrolitresini ekleyin.
Kısa bir santrifüjden sonra karışımı 10 dakika boyunca 99 derecede denature. Bundan sonra, buz tüpleri yerleştirin ve yoğuşma toplamak için kısa bir süre onları spin. Numuneyi bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 100 voltta bir saat çalıştırın.
Sonra jeli bir gecede lekele. Ve art arda üç yıkAma sırasında destain. İlk her spin sütununa 500 mikrolitre denge tamponu ekleyin.
Sütunu üç dakika santrifüj edin. Akış tan atın ve santrifüjleri bir kez daha tekrarlayın. Bundan sonra sütuna numunenin 500 mikrolitre ekleyin.
Üç dakika boyunca sütun santrifüj ve akış toplamak. Daha sonra daha önce açıklandığı gibi sütun akışını analiz edin. Sütuna 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.
Üç dakika boyunca sütun santrifüj ve akış toplamak. Sütunu 1,5 mililitrelik yeni bir etikete aktarın. Sütuna 50 mikrolitre histon elution arabelleği ekleyin.
Kolon santrifüj sonra histon proteinleri içeren akış kaydedin. Bir kimyasal başlık altında saflaştırılmış histones perklorik asit eklemek 4% perklorik asit nihai konsantrasyon elde etmek için. Pipet yukarı ve aşağı altı kez karıştırmak için.
Örnekteki histones çok konsantre ise, çözelti perklorik asit ilavesi sonra bulutlu olacak. Bundan sonra, tüpü 24 saat boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın. Gece histon yağış başarılı olursa, küçük bir beyaz pelet santrifüj adımından sonra şişenin altında görünür olacaktır.
Art arda adımlarla pelet yıkanırken kolayca şişe alt tan kopabilir gibi pelet rahatsız değil emin olun. Ertesi gün önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerde 75 dakika boyunca numuneleri santrifüj. Dikkatle supernatant aspire ve peletli örnek için 500 mikrolitre buz gibi perklorik asit ekleyin.
Numuneyi maksimum hızda 10 dakika santrifüj ettikten sonra süpernatantı aspire edin. Peleti rahatsız etmemeye dikkat edin numuneye 500 mikrolitre buz gibi aseton ekleyin. Daha sonra supernatant çıkarın ve tüpler 30 dakika boyunca buz üzerinde uncapped kurumasını bekleyin.
Daha sonra tüpleri buzdan çıkarın ve numunenin oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin. Pelet kurutuldıktan sonra steril suyun 30 mikrolitre resuspend. Tüpleri kaplayın ve histones 30 ila 50 dakika buz üzerinde yeniden sağlar.
Peletin yeniden askıda olup olmadığını kontrol ettikten sonra tüpleri yeniden kaplayın ve buzdan çıkarın. Bu protokolde insan mikroglial BV-2 hücrelerinden histones saflaştırılmış ve ekstre bileşimi analiz edilmiştir. Lekeli jel 15 dakika ve 24 saat arasında ekstraksiyon süreleri ham histon özleri genel bileşimi etkilemediğini göstermektedir.
Sütunun matrisine bağlanan histonin etkinliği jelin boyanması ile analiz edildi. Kolon akışında saptanabilir histon proteinlerinin yokluğunda nisbeten %100'lük bir verim elde edildi. Çıkarma süresine bakılmaksızın,
15 dakika, iki saat ya da 24 saat. ilk kolon yıkama ekstresinden histonuz proteinlerin en büyük miktarda ortadan kaldırır. 24 saatlik ekstraksiyon grubundaki saflaştırılmış histon protein fraksiyonları 15 dakikalık ve iki saatlik ekstraksiyon sürelerine kıyasla daha fazla H3 ve H4 histones içeriyordu.
İlk kolon elüsyonu, ikinci eluatta histon proteinlerinin eksikliğinden kanıtlandıkça yaklaşık %100 verimliydi. Ham histones sonra tüm fare beyin çıkarıldı ve post-çevirideğişiklikler ölçüldü. Geniş etkili HADC inhibitörü yanıt olarak, tributyrin, H4K12 asetilasyon ekstre arttı.
Ancak, antikor özgüllüğü ham ekstre kirleri varlığı nedeniyle azalmıştır. Histon arınma protokolü, Sınıf I ve IIb HDAC inhibitörü M344 ile tedavi edilen üçlü transgenik A/D farelerin prefrontal korteksi ile tamamlandı ve tek saf çekirdek histon fraksiyonu H4K12 asetilasyondaki değişiklikler açısından değerlendirildi. M344'e yanıt olarak total histones saptandı ve H4K12 asetilasında önemli bir artış gözlendi.
Bu yordamı denerken, işlem boyunca başarılı histon arınmasını doğrulamak için protokol içinde açıklanan birden çok denetim noktasını gerçekleştirmek için hatırlaman önemlidir. Bu işlemden sonra histon fosforilasyon ve metilasyon durumu ile ilgili ek sorular ele alınabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, laboratuarımızdaki araştırmacıların Alzheimer hastalığında yer alan genetik mekanizmaları analiz etmesinin önünü açtı.
Ancak kromatin modifikasyonunun önemli bir rol oynayacağı hipotezinin olduğu çeşitli hastalık modellerinde kullanılabilir.
