この方法は、ヒト歯卵胞幹細胞を遺伝子操作して治療特性を改善できる場所など、再生医療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、安定したゲノム集積の危険なしにマイクロRNA導入によって幹細胞を改変できることである。2つの卵胞の酵素消化の手順を開始し、前温から室温、ヒトの歯包幹細胞またはhDFSC培養液およびPBSPSG溶液に予め温める。
コラゲターゼタイプIとディスパスIIストックソリューションの各アリコートを解凍します。コラゲラーゼタイプIストック溶液500マイクロリットルと1%抗生物質を含む基底培地の4ミリリットルにジスパーゼIIストック溶液500マイクロリットルを加えることによって消化液を調製する。ヒトの歯包幹細胞分離洗浄バッファーおよび使用される培養培地中の部位汚染を避けるためには、抗生物質剤が含まれなければならない。
抽出した歯包を滅菌ペトリ皿に入れます。10ミリリットルのPBSPSG溶液を加え、抽出した組織を洗浄します。吸引し、溶液を捨てて、洗浄を繰り返すために新鮮なPBSPSG溶液を追加します。
滅菌メスを使用すると、抽出した卵胞を約1 x 1ミリメートルであれば粉々にミンチする。ペトリ皿から50ミリリットルの円錐遠心管に細かく組織とPBSPSG溶液を移し、10ミリリットルのPBSPSG溶液でペトリ皿を洗い、同じチューブに溶液を移します。円錐管を室温で353 x gで10分間遠心する。
5ミリリットルの消化液をパレット組織に加え、溶液と組織を穏やかに混合し、37°Cで混合物を2時間振る振るインキュベーターで5%CO2でインキュベートする。2時間後、消化した細胞と組織懸濁液を室温で10分間353gで遠心分離する。上清を捨て、得られたパレットを6ミリリットルのHDFSC培地で再中断する。
細胞懸濁液を25平方センチメートルの細胞培養フラスコに播種し、37°Cで細胞をインキュベートする。HDFSCの細胞収穫および特性評価がテキストプロトコルに記載されているようにした後、24ウェル細胞培養板中のhDfsをシードする。摂氏37度、CO25%、酸素20%を24時間インキュベートします。
翌日、マイクロRNAの40ピコモールを66.7マイクロリットルの減少した血清培地で希釈し、溶液をボルテックスした。0.67マイクロリットルのカチオン脂質を希釈し、66.7マイクロリットルの還元血清培地でトランスフェクション試薬、溶液をボルテックス、室温で5分間インキュベートする。5分後、希釈済みのトランスフェクション試薬に希釈済みのマイクロRNAを加え、溶液を混合し、室温で15分間インキュベートします。
次に、調製したトランスフェクション複合体を、ドロップワイズで、細胞上の培養培地に直接加える。24ウェル細胞培養プレートを前後に揺らすことで、穏やかに混ぜます。24時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。
トランスフェクションの24時間後、各15ミリリットル円錐形遠心分離管にサンプルの上清を集める。1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、PBSをそれぞれの遠心管に移します。500マイクロリットルの点滴とEDTAを細胞に加え、24ウェルプレートを摂氏37度で3分間インキュベートします。
トリプシンを停止するには、細胞に対して1ミリリットルの細胞培養培地を添加し、溶液をそれぞれの遠心管に移します。細胞を300 x gで遠心し、摂氏4度で10分間遠心します。特に明記されていない限り、ここから氷の上に細胞と試薬を保管してください。
上清を捨て、細胞を100マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁し、細胞溶液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移した。生細胞と死細胞を区別するために、各サンプルに0.5ミリリットルのアミン反応性染料を加えます。溶液を軽く混ぜ、摂氏4度で10分間インキュベートします。
細胞にPBSを1ミリリットル、遠心分離機を300g、摂氏4度で10分間加え、上澄み物を捨てて100マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁し、33マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを加え、溶液を混合し、サンプルを水量計まで光から保護して4°Cで保存します。フローサイトメトリック測定に適したチューブにサンプルを転送し、テキストプロトコルに記載されているゲート方式を使用してフローサイトメトリーを実行します。分離されたヒト歯包幹細胞は、間葉間質細胞の定義に関して記載されたすべての特徴を示し、細胞はプラスチック付着性であり、標準的な培養条件下で形態のようなガラス繊維を示した。
フローサイトメトリック解析では、hDfsがCD29、CD44、CD73、CD90、CD105を含む特定の表面抗原のパネルを発現することが明らかになった。CD45とCD117は不在であった。特定のIn Vitro培養条件下での細胞の脂肪異性、骨形成性、および軟骨発生性分化ポテンシャルを、免疫染色、脂肪酸結合タンパク質:骨カルシン、およびアグレカンによって確認した。
細胞毒性とCy3標識マイクロRNA取り込み効率の定量化に使用される格言戦略はトランスフェクション後24時間で、生細胞の100%におけるマイクロRNA取り込みが確認された。トランスフェクトおよび未感染サンプルの死んだ細胞の同等量は、マイクロRNAが細胞毒性作用を及ぼすことなしに効率的に導入されることを示している。この手順に従って、細胞膜の可塑性のような追加の質問に答えるために、トランスセノニテーションのような他の方法を実行することができます。
