このメジャーは、主要な質問に答えるのに役立ちます。人間学の分野で。その答えは、病理学的状態に対する生理学的終わりの下でのマクロファージの機能における。
この技術の主な利点は、ポリエチレンイミンコーティングが細胞を損なうことなく効率的にen vitroを可能にすることです。最適な用量の下で.この技術の意味は、多くの慢性炎症性疾患および癌の治療および診断に及ぶ。
マクロファージが病因に不可欠な役割を果たす場所。手順を実証するナジアになります。私の研究室の大学院生。
そして、カイシュアン・ワンはシャオフア博士の研究室の大学院生です。アリン酸修飾超常磁性酸化鉄ナノ粒子またはSPIONの最初の調製物は、塩化6水和物のファラスの28グラムを追加します。そして20グラムのファラは、80ミリリットルの脱イオン水を含むビーカーにヘプタハイドレートを自液する。
そして、溶液に窒素を導入するためにガラス導管を使用しています。固形物が溶けるまで撹拌する。反応混合物を1分800回転で攪拌しながら摂氏72度に加熱します。
そして、ビーカーに28%アンモニア水の40ミリリットルを追加します。5分後、9ミリリットルのアリル酸ドロップを賢明に加えます。そして、連続攪拌で3時間摂氏72度で混合物を維持します。
インキュベーションの終わりに、得られた溶液を室温まで冷却する。そして、標準的なプロトコルに従って磁気分離を介して混合物を沈殿させる。次いで沈殿を含むSPIONを絶対エチルアルコールで3回洗浄します。
そして、100ミリリットルのn-ヘキサンで沈殿物をアスペルスする。ジマーカプトアクリル酸を調製するために、SPIONの加えて800ミリグラムのアリン酸を加えたSPIONを修正した。200ミリリットルのn-ヘキサンと400ミリグラムのジマーカプトアクリル酸に分散し、200ミリリットルのアセトンを摂氏60度の水浴中の3つの首のフラスコに分散させた。
次に、1分間に1000回転で攪拌し、還流して、フラスコに200マイクロリットルのトリエチルアミンドロップを加えます。黒色沈殿は、5時間後の磁気分離により得られる。次に、水酸化テトラメチルアンモニウムを使用して、脱イオン水中の親水性SPIONの均質分散液のpHを調整します。
縮退ポリエチレンイミンは、SPIONを付加し、ジマーキャプトをアクリル酸修飾SPIONのコロイド溶液を10キロダルトンポリエチレンイミン溶液にドロップします。500ミリリットルの3つの首のフラスコで、1分間に1000回転で機械的に2時間攪拌する。インキュベーションの終わりに、100キロダルトンの分子量と15ミリリットルの含有量を遮断した超濾過チューブに得られた溶液を追加します。
残りの溶液が1ミリリットルの体積に達するまでサンプルをセントラフを使用します。溶液に脱イオン水を加え、体積を15ミリリットルに戻します。そして、ちょうど実証したように、ソリューションをセントラフィンスして水分補給します。
その後、摂氏4度で保存するための22ミクロンのフィルタを介して溶液をフィルタリングします。siRNAナノ粒子を調製するには、最初に調製した20マイクロモルsiRNA溶液の3マイクロリットルを5つの標識RNAの無料マイクロセントロアフィンスチューブに追加します。0、8、1.6、3.2、6.4マイクログラムのポリエチレンイミンSPIONをそれぞれゼロ、1、2、4、8とラベル付けしたチューブに加えます。
穏やかなピペットと混合した後、ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を形成できるように、室温で30分間サンプルをインキュベートします。そして、I純度アガロースで3%アガロースゲルを調製する。インキュベーションの最後に、各チューブにサンプル5マイクロリットルあたり6X DNAローディングバッファーの1マイクロリットルを追加し、慎重に混合します。
その後、すべてのサンプルをゲルにロードします。そして、5ボルト/センチメートルで電気泳動を実行します。ブロモフェノールブルー染料がゲルの長さの3分の2を移行するまで。
トランスフェクションの1日前に、PBSでRAW264.7細胞培養のようなマウスマイクロファージを洗浄する。そして、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5〜10分間、25%トリプシンの1ミリリットルで細胞を処理します。大部分の細胞が切り離されている場合。
完全なDMENの5ミリリットルでトリプシンを不活性化します。次いで、溶液を数回ピピートして、任意の細胞クラスターを分散させる。細胞懸濁液を無菌15ミリリットルのコナッケルチューブに移して遠心分離します。
その後、カウントのための新鮮な完全なDMENの5ミリリットルで細胞を再中断します。完全なDMEN濃度のミリリットル当たり4.5倍の4番目の細胞に細胞を希釈します。そして、細胞培養インキュベーター中の24時間のインキュベーションのために6つのウェルプレートの各ウェルに培地の2ミリリットルを追加します。
翌日、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子の適切な比率を、ちょうど実証したように穏やかな混合で1.5ミリリットルのRNAストリームマイクロ遠心チューブで調製する。そして、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の適切な体積を、1ミリリットルの新鮮な培地に置き換えられた各ウェルに添加します。ポリエチレンイミンSPION si複合体を調製します。
この例ではポリエチレンイミンSPIONの多くの月は、このようにそれらの潜在的な毒性を最小限に抑えて使用することができます.その後、プレートを慎重に旋回して、ウェルボトム全体にナノ粒子の均等な分布を達成します。その後の細胞更新または遺伝子ノックダウン欠損解析まで、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
ゼータ電位30.5および37ミリボルトのポリエチレンイミンSPIONは、1ミリリットル当たり30マイクログラムまでの濃度で明らかな細胞毒性を示さない。これは、通常、細胞トランスフェクションに使用される濃度よりも約2倍のレンタルです。ポリエチレンイミンSPIONのゼータポテンシャルは48ミリボルトですが有毒です。
検査された最低用量でも。フローサイトメトリーで分析したように、細胞の90%以上は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの鉄で蛍光標識ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体でトランスフェクトすることができます。青い染色を破砕することによって細胞内在化に及ぼすポリエチレンイミンSPION siRNA濃度の影響の評価は、1ミリリットル当たり7.5マイクログラムの鉄での最小検出可能な染色を明らかにする。
しかし、ポリエチレンイミンSPION siRNA取り込みの飽和のために鉄のより高い濃度で増加しない1ミリリットル当たり鉄の15マイクログラムではっきりと目に見えるスポット。ポリエチレンイミンSPIONの収容特異的なsiRNAを有する腹膜マクロファージは、非特異的なsiRNAと比較してタール系mRNAレベルの有意な減少を示す。siRNAがエンドサイトージクルから細胞質に脱出してRNA干渉機械に到達できることを示唆する。
さらに、CD11b陽性およびCD3陽性細胞のポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の単回投与の静脈注射後、CD11bによってナノ粒子のより効率的な取り込みを明らかにし、CD11bによってマクロファージを発現するマクロファージをCD11bによって、検査した全臓器の任意の時点で行う。この手順を試みている間に、37ミリボルト以下の平均データ電位を有するポリエチレンイミンSPIONを調製し、低鉄対siRNA比でポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を調製することを忘れないでください。この技術は、研究者が癌などのヒト疾患の動物モーターにおけるマクロファージを標的とする治療可能性を探求する必要性を比較する。
