Le but global de cette procédure est d’utiliser la microscopie comme un outil pour étudier la phagocytose de l’espèce fongique pathogène Cryptococcus neoformans par son amibe prédateur de l’environnement. Cette vidéo détaille un protocole pour la préparation d’une co-culture de cellules cryptococciques et d’amibe que j’étudiera à l’aide de microscopie confocale à balayage laser et de microscopie électronique de transmission. Les informations obtenues à partir de l’utilisation de ces techniques pourraient jeter un aperçu du comportement des cellules cryptococciques lorsqu’elles sont intériorisées pendant l’infection.
Stries sur les souches fongiques d’essai sur les plaques d’agar YPD. Incuber la plaque pendant 48 heures à 30 degrés Celsius. Racler une boucle de cellules de la plaque de 48 heures et les inoculer dans un flacon conique de 250 millilitres contenant 100 millilitres de bouillon YNB qui est complété par 4% de glucose.
Incuber le flacon à 30 degrés Celsius pendant 24 heures sur un shaker rotatif. Après une période d’incubation de 24 heures, comptez les cellules fongiques à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez le numéro de cellule à un million de cellules par millilitre avec solution tampon physiologique. Cultiver les cellules amibe dans la levure peptone extraire le bouillon de glucose pendant une semaine à 30 degrés Celsius.
Comptez les cellules amibe à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez le nombre de cellules à 10 millions de cellules par millilitre avec le milieu ATCC stérile frais 712. Par la suite, effectuez un test de viabilité à l’aide d’une tache bleue trypan. Il est conseillé de travailler avec des cellules qui montrent au moins 80% de viabilité.
Distribuez une suspension de 200 microlitres de cellules amibe standardisées dans les chambres d’une glissière adhérente. Prévoyez deux heures pour que les cellules adhèrent à la surface à 30 degrés Celsius. Pendant que les cellules d’amibe s’installent, tachent les cellules cryptococciques normalisées avec l’isothiocyanate de fluorescéine.
Agiter doucement les cellules fongiques pendant deux heures à température ambiante et dans l’obscurité. Dispensez la suspension de 200 microlitres des cellules cryptococciques tachées après lavage aux chambres appropriées qui contiennent déjà des cellules amibe. Incuber la co-culture préparée à 30 degrés Celsius pour une période supplémentaire de deux heures.
À la fin de la période de cocubation, lavez les chambres deux fois avec PBS pour enlever toutes les cellules amibes non liées, y compris les cellules cryptococciques non internalisées. Aspirer le glutaraldehyde qui a été utilisé pour fixer les cellules, et laver la chambre deux fois avec PBS. Démantèlez la glissière de chambre.
Visualisez les cellules co-culture à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal. Pour compléter l’analyse ci-dessus, tacher les cellules cryptococciques avec du colorant pHrodo qui permet sélectivement la lecture des cellules piégées à l’intérieur du vacuole alimentaire. Distribuez ces cellules tachées dans les puits d’une plaque de microtiter adhérente noire qui contient déjà des cellules amibe ensemencées.
Mesurer la fluorescence sur un lecteur de microplaque qui peut convertir les signaux logarithmiques en unités de fluorescence relative. Ajoutez cinq millilitres de cellules cryptococciques normalisées au même tube de centrifugeuse qui contient déjà cinq millilitres de cellules amibe standardisées. Laissez le tube reposer pendant deux heures à 30 degrés Celsius.
Aspirer le supernatant après centrifugation. Fixer la pastille qui représente les cellules co-culturenées avec une molaire de phosphate de sodium tamponné 3% glutaraldehyde au pH 7 pendant trois heures. Lavez les cellules co-culturenées une fois avec un tampon de phosphate de sodium.
Fixez-le à nouveau pendant 1 1/2 heure dans un tétoxyde de 1% osmium tamponné similaire suivi d’un lavage. Déshydratez le matériel TEM également connu sous le nom de cellules co-culturenées dans une série d’acétone classée de 30%50%70%95%et 100% pendant 15 minutes chacune. Ici, répétez l’étape finale de déshydratation en deux changements.
Préparer la résine époxy en pesant l’époxy de consistance normale. Intégrer le matériau dans la résine époxy. Polymériser le matériau TEM pendant huit heures à 70 degrés Celsius.
Couper les sections de 16 nanomètres avec des couteaux en verre montés sur l’ultratome. Tacher les sections avec de l’acétate d’uranyle pendant 10 minutes dans l’obscurité suivie d’un citrate de plomb pendant 10 minutes, également dans l’obscurité. Visualisez les sections au microscope électronique de transmission.
À des fins illustratives, dans la vidéo, deux isolats sont examinés, l’un qui produit des acides gras 3 hydroxy et l’autre qui ne le fait pas. Les acides gras 3 hydroxy sont des métabolites secondaires qui ne jouent pas un rôle dans la croissance des cellules cryptococciques. Voici des instantanés qui montrent des moments interactifs entre Cryptococcus et amibe.
Au point, une cellule cryptococcique avant et après l’internalisation peut être observée. Lors de l’étude de la phagocytose, il est idéal d’utiliser l’imagerie en direct. Cependant, il n’est pas toujours possible pour les chercheurs d’avoir accès à un tel microscope afin de suivre le processus de phagocytose en permanence.
Une solution possible pour compenser cette limitation peut être de compléter les images avec des données quantitatives par la lecture d’unités de fluorescence relative. Le graphique à barres est un exemple de données que j’ai utilisées pour compléter les images. Fait important, les données qualitatives sous forme d’images et les données quantitatives peuvent être prises à différents moments au fil du temps.
En piétinant toutes les informations, on peut commencer à construire une image plus grande de ce qui se passe pendant le processus de phagocytose. D’après les données quantitatives, il est clair de voir que les cellules avec des acides gras 3 hydroxy sont moins sensibles à l’action amibe par rapport aux cellules qui ne produisent pas d’acide gras 3 hydroxy que moins de cellules sont internalisées. Le TEM est particulièrement un outil puissant car il peut donner une vue à vol d’oiseau dans le lumen de la vacuole alimentaire en raison de sa puissance de haute résolution, et c’est le genre de détail qui est souvent manqué lors de l’examen de l’imagerie en direct ainsi que des images fixes.
Dans ce micrographe TEM spécifique, des protubérances à la surface des cellules cryptococciques peuvent clairement être vues. Auparavant, il a été théorisé que ces structures de surface cellulaire sont des canaux par lesquels les acides gras 3 hydroxy sont libérés dans l’environnement environnant. Au point, ces canaux peuvent aider à fournir des acides gras 3 hydroxy dans le lumen du vacuole alimentaire de l’amibe pour modifier les conditions internes, d’où la promotion de la survie cellulaire.
pHrodo ou comme FITC peut être une tache beaucoup mieux à utiliser car il ne fluore à un pH faible, comme à l’intérieur du vacuole alimentaire. Pour être précis, pHrodo permet seulement au chercheur d’obtenir des données concernant les cellules internalisées. À cette fin, il est important que les cellules soient suspendues dans une solution tampon de phosphate avant la coloration et que les médias amibe soient d’un pH neutre.
Les opérateurs de microscope électronique de transmission doivent être bien formés à la section correctement car c’est souvent le point où les résultats pourraient être déformés et micrographe endommagé par le bombardement électronique. Il est prévu que les chercheurs seront en mesure de prendre suffisamment d’informations à partir du protocole présenté et de les optimiser dans leurs propres études. En outre, les chercheurs peuvent également développer des anticorps contre le métabolite ciblé et les appliquer pendant leur étude immunofluorescente de microscopie comprenant l’étiquetage d’immunogold pendant l’examen de TEM.
