המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופיה ככלי לחקר הפגוציטוזיס של המין הפטרייתי הפתוגניים Cryptococcus neoformans על ידי אמבה הטורף הסביבתי שלה. וידאו זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ואמבה אשר אני אלמד באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקאלי מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור. מידע המתקבל משימוש בטכניקות אלה יכול לשפוך תובנות על התנהגותם של תאים קריפטו-אקוסאליים כאשר הם מוחפנים במהלך ההדבקה.
תפסו את הזנים הפטרייתיים של המבחן על צלחות אגר YPD. דגירה הצלחת במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. מגרדים לולאה של תאים מהצלחת בת 48 השעות ומחסן אותם לתוך בקבוק חרוט 250 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של מרק YNB כי הוא בתוספת 4% גלוקוז.
דגירה הבקבוק ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות על שייקר סיבובי. לאחר תקופת דגירה של 24 שעות, לספור את התאים הפטרייתיים באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התא למיליון תאים למיליליטר עם פתרון חיץ פיזיולוגי. מטפחים תאי אמבה בשמרי פפטון מחלצים מרק גלוקוז במשך שבוע ב-30 מעלות צלזיוס.
לספור את תאי amoeba באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התא ל 10 מיליון תאים למיליליטר עם בינוני ATCC סטרילי טרי 712. לאחר מכן, בצע בדיקת כדאיות באמצעות כתם כחול טריפאן. מומלץ לעבוד עם תאים ה מראים לפחות 80%הכדאיות.
לוותר על השעיה 200 מיקרוליטר של תאי אמובה מתוקננים לתאים של שקופית חסידה. אפשר שעתיים לעבור לתאים לדבוק על פני השטח ב 30 מעלות צלזיוס. בעוד תאי אמבה מתיישבים, להכתים את תאי cryptococcal מתוקן עם פלואורסין isothiocyanate.
מתסיסים בעדינות את התאים הפטרייתיים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ובחושך. לוותר על 200 מיקרוליטר השעיה של תאים cryptococcal מוכתמים לאחר שטיפה לתאים המתאימים שכבר מכילים תאי אמובה. הדגירה את התרבות ההפוכה ב 30 מעלות צלזיוס לתקופה נוספת של שעתיים.
בסוף תקופת המטבע, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS כדי להסיר את כל תאי amoeba לא מאוגדים כולל תאים cryptococcal לא מופנם. שאפו את הגלוטארלדהיד ששימש לתיקון התאים, ושטפו את התא פעמיים עם PBS. לפרק את השקופית התאית.
הצג את התאים התת-תרבותיים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. כדי להשלים את ההתעקשות לעיל, להכתים את התאים cryptococcal עם צבע pHrodo אשר באופן סלקטיבי מאפשר קריאה של תאים לכודים בתוך vacuole מזון. מחלקים את התאים המוכתמים האלה לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר חסיד שחור שכבר מכילה תאי אמבה זרעים.
למדוד פלואורסצנטיות על קורא מיקרופלסטיק שיכול להמיר אותות לוגריתמיים ליחידות פלואורסצנטיות יחסית. הוסף חמישה מיליליטר של תאים קריפטו-ccal מתוקננים לאותו צינור צנטריפוגה שכבר מכיל חמישה מיליליטר של תאי אמובה מתוקננים. אפשר לצינור לעמוד במשך שעתיים ב-30 מעלות צלזיוס.
שאף את העל-טבעי לאחר הצנטריפוגה. תקן את גלולה המייצג את תאים מתורבתים במשותף עם טוחנת אחת של נתרן פוספט מאגר 3%glutaraldehyde ב pH 7 במשך שלוש שעות. לשטוף את התאים בתרבות שותף פעם אחת עם מאגר נתרן פוספט.
תקן שוב במשך 1 1/2 שעות במאגר דומה 1%osmium tetroxide ואחריו כביסה. ייבש את חומר ה- TEM הידוע גם כתאים מתורבתים במשותף בסדרת אצטון מדורגת של 30%50%70%95% ו- 100% במשך 15 דקות כל אחד. כאן, חזור על שלב ההתייבשות הסופי בשני שינויים.
הכן את שרף אפוקסי על ידי שקילה את אפוקסי של עקביות נורמלית. להטמיע חומר לתוך שרף אפוקסי. פולימריזציה של חומר TEM במשך שמונה שעות ב 70 מעלות צלזיוס.
חותכים קטעים של 16 ננומטר עם סכיני זכוכית המותקנים על האולטרה-אטומ. להכתים את החלקים עם אצטט אורניל במשך 10 דקות בחושך ואחריו ציטראט עופרת במשך 10 דקות, גם בחושך. הצג את החלקים עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
לשם המחשה, בסרטון נבדקים שני מבודדים, האחד מייצר חומצת שומן 3-הידרוקסי והשני שאינו. להלן תמונות המוצגות רגעים אינטראקטיביים בין קריפטוקוס לאמבה.
לנקודה, תא cryptococcal לפני ואחרי הפנמה ניתן לראות. כאשר לומדים phagocytosis, זה אידיאלי לעשות שימוש הדמיה חיה. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי עבור חוקרים יש גישה למיקרוסקופ כזה על מנת לעקוב אחר תהליך של phagocytosis ברציפות.
פתרון אפשרי לפיצוי על מגבלה זו עשוי להיות השלמת תמונות עם נתונים כמותיים באמצעות קריאה של יחידות פלואורסצנטיות יחסית. גרף עמודות הוא דוגמה לנתונים שבהם השתמשתי כדי להשלים את התמונות. חשוב לציין, הן את הנתונים האיכותיים בצורה של תמונות ואת הנתונים הכמותיים ניתן לקחת בנקודות זמן שונות לאורך זמן.
על ידי piecing כל המידע, אפשר להתחיל לבנות תמונה גדולה יותר של מה שמתרחש במהלך תהליך של phagocytosis. מהנתונים הכמותיים, ברור לראות כי התאים עם חומצות שומן 3-הידרוקסי רגישים פחות לפעולת אמבה בהשוואה לתאים שאינם מייצרים חומצת שומן 3-הידרוקסי כמו תאים פחות מופנמים. TEM הוא כלי רב עוצמה במיוחד כפי שהוא יכול לתת מבט ממעוף הציפור לתוך הלומן של vacuole מזון בגלל כוחו ברזולוציה גבוהה, וזה סוג של פרט כי הוא החמיץ לעתים קרובות בעת בחינת הדמיה חיה, כמו גם תמונות סטילס.
במיקרוגרף TEM ספציפי זה, ניתן לראות בבירור פרובינסים על פני השטח של תאים קריפטו-סקופיים. בעבר, זה היה תיאוריה כי מבנים אלה פני השטח של התא הם ערוצים שבהם 3-הידרוקסי חומצות שומן משתחררים לסביבה שמסביב. לעניין, ערוצים אלה עשויים לעזור לספק 3-הידרוקסי חומצות שומן לתוך הלומן של vacuole המזון של אמבה כדי לשנות את התנאים הפנימיים, ומכאן קידום ההישרדות של התא.
pHrodo או כמו FITC עשוי להיות כתם הרבה יותר טוב להשתמש כפי שהוא רק פלואורסצנטי ב- pH נמוך, כמו בתוך vacuole מזון. כדי להיות ספציפי, pHrodo רק מאפשר לחוקר להשיג נתונים לגבי תאים הפנימו. לשם כך, חשוב כי תאים מושעים בת פתרון חיץ פוספט לפני הכתמה, כי מדיה amoeba הוא של pH ניטרלי.
מפעילי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור הם להיות מאומנים היטב לקטע כראוי כמו זה לעתים קרובות הנקודה שבה התוצאות יכולות להיות מעוותות מיקרוגרף פגום על ידי הפצצת אלקטרונים. הוא חזה כי החוקרים יוכלו לקחת מספיק מידע מהפרוטוקול שהוצג ולייעל אותם במחקרים שלהם. יתר על כן, החוקרים עשויים גם לפתח נוגדנים נגד מטבוליט ממוקד ולהחיל אותם במהלך מחקר מיקרוסקופיה immunofluorescent שלהם כולל תיוג אימונוגולד במהלך בדיקת TEM.
