Der allgemeine Zweck dieses Verfahrens ist es, Mikroskopie als Werkzeug zu verwenden, um die Phagozytose der pathogenen Pilzart Cryptococcus neoformans durch seine Umwelt Raubtier Amöbe zu studieren. Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die ich mit konfokaler Laserscanmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie untersuchen werde. Informationen, die durch die Verwendung dieser Techniken gewonnen werden, könnten Einblicke in das Verhalten von Kryptokokkenzellen geben, wenn sie während der Infektion internalisiert werden.
Streichen Sie die Testpilzstämme auf YPD AgarPlatten. Inkubieren Sie die Platte für 48 Stunden bei 30 Grad Celsius. Schrotten Sie eine Schleife von Zellen aus der 48 Stunden alten Platte und impfen Sie sie in einen 250-Milliliter konischen Kolben mit 100 Milliliter NYNB Brühe, die mit 4% Glukose ergänzt wird.
Den Kolben bei 30 Grad Celsius 24 Stunden lang auf einem Drehschüttler bebrüten. Zählen Sie nach einer 24-stündigen Inkubationszeit die Pilzzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl mit physiologischer Pufferlösung auf eine Million Zellen pro Milliliter an. Kultivieren Sie Amöbenzellen in Peptonhefe Extrakt Glukosebrühe für eine Woche bei 30 Grad Celsius.
Zählen Sie die Amöbenzellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellzahl auf 10 Millionen Zellen pro Milliliter mit frischem sterilem ATCC-Medium 712 an. Führen Sie anschließend einen Lebensfähigkeitstest mit einem Trypanenblaufleck durch. Es ist ratsam, mit Zellen zu arbeiten, die mindestens 80% Lebensfähigkeit aufweisen.
Geben Sie eine 200-Mikroliter-Suspension standardisierter Amöbenzellen in Die Kammern eines haftenden Schlittens. Lassen Sie zwei Stunden vergehen, damit Zellen bei 30 Grad Celsius an der Oberfläche haften. Während sich Amöbenzellen absetzen, färben die standardisierten Kryptokokkenzellen mit Fluorescein-Isothiocyanat.
Rühren Sie die Pilzzellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und im Dunkeln sanft auf. 200-Mikroliter-Suspension von gefärbten Kryptokokkenzellen nach dem Waschen in geeignete Kammern geben, die bereits Amöbenzellen enthalten. Die vorbereitete Kokultur bei 30 Grad Celsius für einen zusätzlichen Zeitraum von zwei Stunden inkubieren.
Am Ende der Coinkubationszeit, waschen Sie die Kammern zweimal mit PBS, um alle ungebundenen Amöbenzellen einschließlich nicht-internalisierter Kryptokokkenzellen zu entfernen. Aspirieren Sie das Glutaraldehyd, das verwendet wurde, um die Zellen zu fixieren, und waschen Sie die Kammer zweimal mit PBS. Zerlegen Sie die Kammerrutsche.
Sehen Sie sich die ko-kultivierten Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop an. Um den obigen Test zu ergänzen, färben Sie die Kryptokokkenzellen mit pHrodo-Farbstoff, der selektiv das Lesen von Zellen ermöglicht, die im Nahrungsvakuum gefangen sind. Geben Sie diese gebeizten Zellen in die Brunnen einer schwarzen, anhaftenden Mikrotiterplatte, die bereits gesäte Amöbenzellen enthält.
Messen Sie die Fluoreszenz an einem Mikroplattenleser, der logarithmische Signale in relative Fluoreszenzeinheiten umwandeln kann. Fügen Sie fünf Milliliter standardisierter Kryptokokkenzellen in das gleiche Zentrifugenrohr ein, das bereits fünf Milliliter standardisierte Amöbenzellen enthält. Lassen Sie die Röhre für zwei Stunden bei 30 Grad Celsius stehen.
Aspirieren Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Fixieren Sie das Pellet, das die ko-kultivierten Zellen darstellt, mit einem Molaren Natriumphosphat gepuffert 3%glutaraldehyd bei pH 7 für drei Stunden. Waschen Sie die ko-kultivierten Zellen einmal mit Natriumphosphatpuffer.
Fix wieder für 1 1/2 Stunden in ähnlich gepuffert 1%Osmiumtetroxid gefolgt von Waschen. Dehydrieren Sie das TEM-Material, auch bekannt als die ko-kultivierten Zellen in einer abgestuften Aceton-Serie von 30%50%70%95%und 100% für jeweils 15 Minuten. Wiederholen Sie hier den letzten Austrocknungsschritt in zwei Änderungen.
Bereiten Sie das Epoxidharz vor, indem Sie Epoxid der normalen Konsistenz abwägen. Material in das Epoxidharz einbetten. Polymerisieren Sie das TEM-Material acht Stunden lang bei 70 Grad Celsius.
Schneiden Sie 16-Nanometer-Abschnitte mit Glasmessern auf dem Ultratome montiert. Die Abschnitte mit Uranylacetat 10 Minuten im Dunkeln färben, gefolgt von Bleicitrat für 10 Minuten, auch im Dunkeln. Sehen Sie sich die Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop an.
Zur Veranschaulichung werden im Video zwei Isolate untersucht, eines, das 3-Hydroxy-Fettsäure produziert, und das andere nicht. 3-Hydroxy-Fettsäuren sind sekundäre Metaboliten, die keine Rolle beim Wachstum von Kryptokokkenzellen spielen. Hier sind Schnappschüsse, die interaktive Momente zwischen Cryptococcus und Amöben zeigen.
Auf den Punkt gebracht, kann eine Kryptokokkenzelle vor und nach der Internalisierung beobachtet werden. Beim Studium der Phagozytose ist es ideal, live bildgebende Bilder zu verwenden. Es ist jedoch nicht immer möglich, dass Forscher Zugang zu einem solchen Mikroskop haben, um den Prozess der Phagozytose kontinuierlich zu verfolgen.
Eine mögliche Lösung, um diese Einschränkung auszugleichen, könnte darin bestehen, Bilder durch das Lesen relativer Fluoreszenzeinheiten mit quantitativen Daten zu ergänzen. Das Balkendiagramm ist ein Beispiel für Daten, die ich verwendet habe, um die Bilder zu ergänzen. Wichtig ist, dass sowohl die qualitativen Daten in Form von Bildern als auch die quantitativen Daten im Laufe der Zeit zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgenommen werden können.
Indem man alle Informationen pieciert, kann man beginnen, ein größeres Bild dessen zu konstruieren, was während des Prozesses der Phagozytose geschieht. Aus den quantitativen Daten geht hervor, dass die Zellen mit 3-Hydroxy-Fettsäuren weniger anfällig für Amöbensind sind, wenn sie mit Zellen verglichen werden, die keine 3-Hydroxy-Fettsäure produzieren, da weniger Zellen verinnerlicht werden. Das TEM ist ein besonders leistungsfähiges Werkzeug, da es aufgrund seiner hohen Auflösungskraft einen Blick aus der Vogelperspektive in das Lumen des Nahrungsvakuums geben kann, und dies ist die Art von Details, die bei der Untersuchung von Live-Bildgebung sowie Standbildern oft übersehen werden.
In diesem spezifischen TEM-Mikrographen sind Protuberanzen auf der Oberfläche von Kryptokokkenzellen deutlich zu sehen. Zuvor wurde theoretisiert, dass diese Zelloberflächenstrukturen Kanäle sind, durch die 3-Hydroxy-Fettsäuren in die Umgebung freigesetzt werden. Bis zu dem Punkt, Diese Kanäle können helfen, 3-Hydroxy-Fettsäuren in das Lumen der Nahrung Vakuole von Amöben zu liefern, um die inneren Bedingungen zu ändern, daher die Förderung des Zellüberlebens.
pHrodo oder wie FITC kann ein viel besserer Fleck zu verwenden, da es nur fluoreszieren bei einem niedrigen pH-Wert, wie innerhalb der Nahrung Vakuole. Um genau zu sein, pHrodo erlaubt dem Forscher nur, Daten über internalisierte Zellen zu erhalten. Zu diesem Zweck ist es wichtig, dass die Zellen vor der Färbung in der Phosphatpufferlösung suspendiert werden und dass Amöbenmedien einen neutralen pH-Wert haben.
Transmissionselektronenmikroskop-Betreiber müssen gut ausgebildet sein, um richtig zu schneiden, da dies oft der Punkt ist, an dem die Ergebnisse verzerrt und die Mikrographik durch Elektronenbeschuss beschädigt werden könnte. Es ist vorgesehen, dass die Forscher in der Lage sein werden, genügend Informationen aus dem vorgelegten Protokoll zu nehmen und sie in ihren eigenen Studien zu optimieren. Darüber hinaus können Forscher auch Antikörper gegen gezielte Metaboliten entwickeln und sie während ihrer immunfluoreszierenden Mikroskopiestudie einschließlich der Immungold-Kennzeichnung während der TEM-Untersuchung anwenden.
