El propósito general de este procedimiento es utilizar la microscopía como una herramienta para estudiar la fagocitosis de la especie fúngica patógena Cryptococcus neoformans por su ameba depredador ambiental. Este video detalla un protocolo para preparar una co-cultura de células criptocócicas y amebas que estudiaré usando microscopía de escaneo láser confocal y microscopía electrónica de transmisión. La información obtenida del uso de estas técnicas podría arrojar información sobre el comportamiento de las células criptocócicas cuando se internaliza durante la infección.
Estirar las cepas de hongos de prueba en placas de agar YPD. Incubar la placa durante 48 horas a 30 grados centígrados. Raspa un bucle lleno de células de la placa de 48 horas de edad e inocularlas en un matraz cónico de 250 mililitros que contiene 100 mililitros de caldo YNB que se complementa con 4%glucosa.
Incubar el matraz a 30 grados centígrados durante 24 horas en una coctelera giratoria. Después de un período de incubación de 24 horas, cuente las células fúngicas usando un hemocitometro y ajuste el número de célula a un millón de células por mililitro con solución de tampón fisiológico. Cultivar células de ameba en caldo de glucosa de extracto de levadura de peptona durante una semana a 30 grados centígrados.
Cuente las células de ameba usando un hemocitoómetro y ajuste el número de células a 10 millones de células por mililitro con un medio ATCC estéril fresco 712. Después de esto, realice un ensayo de viabilidad usando una mancha azul tripano. Es aconsejable trabajar con células que muestren al menos 80% de viabilidad.
Dispensar una suspensión de 200 microlitros de células de ameba estandarizadas en las cámaras de un portaobjetos adherente. Deje pasar dos horas para que las células se adhieran a la superficie a 30 grados centígrados. Mientras que las células de ameba se están asentando, manchar las células criptocócicas estandarizadas con isotiocianato de fluoresceína.
Agitar suavemente las células fúngicas durante dos horas a temperatura ambiente y en la oscuridad. Dispensar la suspensión de 200 microlitros de las células criptocócicas teñidas después de lavarlas en las cámaras apropiadas que ya contienen células de ameba. Incubar el co-cultivo preparado a 30 grados centígrados durante un período adicional de dos horas.
Al final del período de coincución, lave las cámaras dos veces con PBS para eliminar las células de ameba no enlazadas, incluidas las células criptocócicas no internalizadas. Aspirar el glutaraldehído que se utilizó para fijar las células, y lavar la cámara dos veces con PBS. Desmontar el tobogán de la cámara.
Vea las células co-cultivadas usando un microscopio de escaneo láser confocal. Para complementar el ensayo anterior, manche las células criptocócicas con tinte pHrodo que permite selectivamente la lectura de las células atrapadas dentro de la vacuola de los alimentos. Dispensar estas células manchadas en los pozos de una placa de microtíter frontal negro que ya contiene células de ameba desconfiadas.
Mida la fluorescencia en un lector de microplacas que puede convertir señales logarítmicas en unidades de fluorescencia relativas. Agregue cinco mililitros de células criptocócicas estandarizadas al mismo tubo centrífugo que ya contiene cinco mililitros de células de ameba estandarizadas. Deje que el tubo se ponga de pie durante dos horas a 30 grados centígrados.
Aspirar el sobrenadante después de la centrifugación. Fijar el pellet que representa las células co-cultivadas con un molar de fosfato sódico tamponado 3%glutaraldehído en pH 7 durante tres horas. Lave las células co-cultivadas una vez con tampón de fosfato sódico.
Se corrige de nuevo durante 1 1/2 horas en un 1%de tetróxido de osmio amortiguado de forma similar seguido de lavado. Deshidratar el material TEM también conocido como las células co-cultivadas en una serie de acetonas calificadas de 30%50%70%95% y 100% durante 15 minutos cada una. Aquí, repita el paso final de deshidratación en dos cambios.
Preparar la resina epoxi pesando epoxi de consistencia normal. Incrustar material en la resina epoxi. Polimerizar el material TEM durante ocho horas a 70 grados Centígrados.
Corte secciones de 16 nanómetros con cuchillos de vidrio montados en el ultratome. Mancha las secciones con acetato de uranilo durante 10 minutos en la oscuridad seguido de citrato de plomo durante 10 minutos, también en la oscuridad. Vea las secciones con un microscopio electrónico de transmisión.
Para fines ilustrativos, en el video, se examinan dos aislados, uno que produce ácidos grasos 3-hidroxi y el otro que no. 3-hidroxi ácidos grasos son metabolitos secundarios que no juegan papel en el crecimiento de células criptocócicas. Aquí hay instantáneas que muestran momentos interactivos entre Cryptococcus y amoebae.
Hasta el punto, se puede observar una celda criptocócica antes y después de la internalización. Al estudiar la fagocitosis, es ideal para hacer uso de imágenes en vivo. Sin embargo, no siempre es posible que los investigadores tengan acceso a un microscopio de este tipo para seguir continuamente el proceso de fagocitosis.
Una posible solución para compensar esta limitación puede ser complementar las imágenes con datos cuantitativos mediante la lectura de unidades de fluorescencia relativas. El gráfico de barras es un ejemplo de datos que utilicé para complementar las imágenes. Es importante destacar que tanto los datos cualitativos en forma de imágenes como los datos cuantitativos pueden tomarse en diferentes momentos a lo largo del tiempo.
Al piecing toda la información, uno puede comenzar a construir una imagen más grande de lo que sucede durante el proceso de fagocitosis. A partir de los datos cuantitativos, es claro ver que las células con ácidos grasos 3-hidroxi son menos susceptibles a la acción de la ameba en comparación con las células que no producen ácido graso 3-hidroxi como menos células se internalizan. El TEM es particularmente una herramienta poderosa, ya que puede dar una vista de pájaro en el lumen de la vacuola de alimentos debido a su alta potencia de resolución, y este es el tipo de detalle que a menudo se pierde al examinar imágenes en vivo, así como imágenes fijas.
En este micrografo TEM específico, se pueden ver claramente las protuberancias en la superficie de las células criptocócicas. Anteriormente, se teorizó que estas estructuras superficiales celulares son canales por los cuales se liberan ácidos grasos 3-hidroxi en el entorno circundante. Hasta el punto, estos canales pueden ayudar a entregar ácidos grasos 3-hidroxi en el lumen de la vacuola de alimentos de amebas para alterar las condiciones internas, de ahí la promoción de la supervivencia celular.
pHrodo o como FITC puede ser una mancha mucho mejor para usar, ya que sólo es fluorescencia a un pH bajo, como dentro de la vacuola de alimentos. Para ser específicos, pHrodo sólo permite al investigador obtener datos relativos a las células internalizadas. Con este fin, es importante que las células se suspendan en la solución tampón de fosfato antes de la tinción y que los medios de ameba sean de pH neutro.
Los operadores de microscopios electrónicos de transmisión deben estar bien entrenados para secarse correctamente, ya que este es a menudo el punto en el que los resultados podrían distorsionarse y el micrografo dañado por el bombardeo de electrones. Se prevé que los investigadores puedan tomar suficiente información del protocolo presentado y optimizarlos en sus propios estudios. Además, los investigadores también pueden desarrollar anticuerpos contra el metabolito objetivo y aplicarlos durante su estudio de microscopía inmunofluorescente, incluido el etiquetado de inmunodulados durante el examen TEM.
