الغرض العام من هذا الإجراء هو استخدام المجهر كأداة لدراسة البلعميات من الأنواع الفطرية المسببة للأمراض Cryptococcus neoformans بواسطة أميبا المفترس البيئي. هذا الفيديو تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة المشتركة للخلايا cryptococcal وmoebae التي سوف دراسة باستخدام المجهر ليزر المسح confocal ونقل المجهر الإلكترون. يمكن للمعلومات التي يتم الحصول عليها من استخدام هذه التقنيات أن تلقي برؤى حول سلوك الخلايا المكوّنة على التشفير عند تدخيلها أثناء الإصابة.
خط خارج سلالات الفطرية اختبار على لوحات YPD أجار. احتضان لوحة لمدة 48 ساعة في 30 درجة مئوية. كشط قبالة loopful من الخلايا من لوحة 48 ساعة من العمر وتطعيم لهم في قارورة مخروطية 250 ملليلتر تحتوي على 100 ملليلتر من مرق YNB التي تستكمل مع 4٪ الجلوكوز.
احتضان القارورة في 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على شاكر دوار. بعد فترة حضانة لمدة 24 ساعة، عد الخلايا الفطرية باستخدام قياس الهيموسيت وضبط رقم الخلية إلى مليون خلية لكل ملليلتر مع محلول عازلة الفسيولوجية. زراعة خلايا الأميبا في الخميرة الببتون استخراج مرق الجلوكوز لمدة أسبوع في 30 درجة مئوية.
عد خلايا الأميبا باستخدام مقياس الهيموسيتات وضبط رقم الخلية إلى 10 ملايين خلية لكل ملليلتر مع ATCC معقم جديد متوسط 712. بعد ذلك، إجراء مقايسة قابلة للحياة باستخدام وصمة عار زرقاء trypan. فمن المستحسن للعمل مع الخلايا التي تظهر على الأقل 80٪ القدرة على البقاء.
الاستغناء عن تعليق 200 ميكرولتر من خلايا الأميبا الموحدة في غرف من الشريحة المتمسك. السماح لمدة ساعتين لتمرير الخلايا للتمسك السطح في 30 درجة مئوية. في حين أن خلايا الأميبا تستقر ، وصمة عار الخلايا المشفرة الموحدة مع isoescein isothiocyanate.
يهيج الخلايا الفطرية بلطف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. الاستغناء عن تعليق 200 ميكرولتر من خلايا المكورات المشفرة الملطخة بعد غسلها إلى الغرف المناسبة التي تحتوي بالفعل على خلايا الأميبا. احتضان الثقافة المشتركة المعدة في 30 درجة مئوية لفترة إضافية من ساعتين.
في نهاية فترة الاحتراق، وغسل الغرف مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي خلايا الأميبا غير منضم بما في ذلك خلايا cryptococcal غير داخلي. البيربيرات الجلوتارالديهيد الذي كان يستخدم لإصلاح الخلايا، وغسل الغرفة مرتين مع برنامج تلفزيوني. تفكيك الشريحة الغرفة.
عرض الخلايا المشتركة في الثقافة باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر confocal. لاستكمال الفحص أعلاه ، وصمة عار الخلايا المشفرة مع صبغة pHrodo التي تسمح بشكل انتقائي لقراءة الخلايا المحاصرين داخل فاكولي الغذاء. الاستغناء عن هذه الخلايا الملطخة في آبار لوحة microtiter الأسود الملتزم الذي يحتوي بالفعل على خلايا الأميبا المصنفة.
قياس الفلوريسنس على قارئ الصهريج الصغير الذي يمكنه تحويل الإشارات اللوغاريتمية إلى وحدات الفلورانسية النسبية. إضافة خمسة ملليلترات من خلايا cryptococcal موحدة إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي بالفعل على خمسة ملليلترات من خلايا الأميبا الموحدة. السماح للأنبوب على الوقوف لمدة ساعتين في 30 درجة مئوية.
استلهم الطارد بعد الطرد المركزي. إصلاح بيليه الذي يمثل الخلايا المشتركة في الثقافة مع الضرس واحد من فوسفات الصوديوم المخزنة 3٪ glutaraldehyde في الرقم الH 7 لمدة ثلاث ساعات. غسل الخلايا المشتركة في الثقافة مرة واحدة مع العازلة فوسفات الصوديوم.
إصلاح مرة أخرى لمدة 1 1/2 ساعة في المخزنة بالمثل 1٪ أوزميوم تتروكسيد تليها الغسيل. يجفف المواد TEM المعروف أيضا باسم الخلايا المشتركة في الثقافة في سلسلة الأسيتون متدرج من 30٪50٪70٪95٪و 100٪ لمدة 15 دقيقة لكل من. هنا، كرر خطوة الجفاف النهائية في تغييرين.
إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق وزنها قبالة الايبوكسي من الاتساق العادي. تضمين المواد في راتنج الايبوكسي. البلمرة المواد TEM لمدة ثماني ساعات في 70 درجة مئوية.
قطع 16 نانومتر المقاطع مع السكاكين الزجاجية التي شنت على ultratome. وصمة عار المقاطع مع خلات أورانيل لمدة 10 دقائق في الظلام تليها سيترات الرصاص لمدة 10 دقائق، وأيضا في الظلام. عرض المقاطع مع المجهر الإلكتروني انتقال.
لأغراض توضيحية، في الفيديو، يتم فحص اثنين من العزل، واحد التي تنتج الأحماض الدهنية 3 هيدروكسي والآخر أن لا. 3-الأحماض الدهنية هيدروكسي هي المستقلبات الثانوية التي لا تلعب دورا في نمو الخلايا المكورة المشفرة. وهنا لقطات التي تظهر لحظات تفاعلية بين Cryptococcus وmoebae.
إلى هذه النقطة، يمكن ملاحظة خلية المكوّنة على التشفير قبل وبعد استيعاب. عند دراسة البلعوم، فمن المثالي الاستفادة من التصوير الحي. ومع ذلك ، فإنه ليس من الممكن دائما للباحثين الحصول على مثل هذا المجهر من أجل متابعة عملية البلعمة بشكل مستمر.
وقد يكون الحل الممكن للتعويض عن هذا القيد هو تكملة الصور ببيانات كمية من خلال قراءة وحدات الفلورية النسبية. الرسم البياني الشريطي مثال على البيانات التي استخدمتها لتكملة الصور. والأهم من ذلك، يمكن أخذ كل من البيانات النوعية في شكل صور والبيانات الكمية في نقاط زمنية مختلفة على مدى الزمن.
عن طريق تجميع جميع المعلومات، يمكن للمرء أن يبدأ في بناء صورة أكبر لما يحدث خلال عملية البلعوم. من البيانات الكمية، فمن الواضح أن نرى أن الخلايا مع 3-hydroxy الأحماض الدهنية هي أقل عرضة للعمل الأميبا بالمقارنة مع الخلايا التي لا تنتج 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية كما يتم استيعاب عدد أقل من الخلايا. وTEM هو أداة قوية بشكل خاص لأنها يمكن أن تعطي نظرة الطيور العين في تجويف الطعام بسبب قوتها عالية الدقة، وهذا هو نوع من التفاصيل التي غالبا ما غاب عند فحص التصوير الحي، فضلا عن الصور الثابتة.
في هذا ميكروجراف TEM محددة، protuberances على سطح الخلايا cryptococcal يمكن أن ينظر بوضوح. سابقا، كان من المُتنظير أن هذه الهياكل السطحية للخلايا هي قنوات يتم من خلالها إطلاق الأحماض الدهنية ثلاثية الهيدروكسي في البيئة المحيطة. إلى هذه النقطة، قد تساعد هذه القنوات على تقديم 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية في تجويف الطعام من الأمويباي لتغيير الظروف الداخلية، وبالتالي تعزيز بقاء الخلية.
pHrodo أو مثل فيتك قد يكون وصمة عار أفضل بكثير لاستخدامها لأنها الفلوريس فقط في انخفاض نسبة الHH، مثل داخل فاكولي الغذاء. أن تكون محددة، pHrodo يسمح فقط الباحث للحصول على البيانات المتعلقة بالخلايا الداخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم أن يتم تعليق الخلايا في محلول الفوسفات العازل قبل تلطيخ وأن وسائل الإعلام الأميبا هو من علامة PH محايدة.
يجب تدريب مشغلي المجهر الإلكتروني للإرسال بشكل جيد على القسم بشكل صحيح لأن هذا هو في كثير من الأحيان النقطة التي يمكن أن تكون فيها النتائج مشوهة وميكروجراف معطوب من القصف الإلكتروني. ومن المتوخى أن يتمكن الباحثون من أخذ ما يكفي من المعلومات من البروتوكول المقدم والاستفادة المثلى منها في دراساتهم الخاصة. وعلاوة على ذلك، قد يطور الباحثون أيضًا أجسامًا مضادة ضد المستقلب المستهدف ويطبقونها أثناء دراستهم المجهرية في الفلورسنت المناعي بما في ذلك وضع العلامات المناعية أثناء فحص TEM.
