この方法は、日常的に処理される生検材料からバイオマーカータンパク質を定量化することによって、癌病理の分野における重要な質問に答えることができます。従来の免疫検査に関連してこの技術の主な利点は、それが客観的であり、広いダイナミックレンジを有し、そして特定の細胞タイプにおけるタンパク質の定量化を可能にする。特定のいわゆるバイオマーカータンパク質の有無、またはより詳細には、癌生検標本におけるそれらのタンパク質の相対的な存在量は、特定の種類の癌の特定の病理学的診断を行う上で非常に有用であり得る。
しかし、がん治療に対する反応を予測するのにも役立つため、この技術はがん患者の診断と治療の両方に関連しています。このプロトコルは、免疫蛍光ベースアッセイの定量性を検証するために、不死化細胞株におけるタンパク質定量法の使用法を主に説明します。しかし、免疫蛍光は多重化されたアプローチに容易に組み込まれ、一次生検サンプルに適用できることに注意することが重要です。
この手順を支援し、デモンストレーションを行うのは、技術者のリー・ブードローとオペレーションディレクターのシェイケル・ヴァークです。両方とも女王の分子病理学研究所から。まず、前に収穫した細胞を225 Gsの50ミリリットル円錐管で5分間遠心分離する。
上清をデカントし、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで再懸濁させた。次いで、再懸濁した細胞を225Gsで5分間遠心分離する。10%NBFの10ミリリットルで細胞ペレットを懸濁します。
その後、一晩24 RPMでロッカーの室温で細胞をインキュベートします。細胞を固定した後、225 Gsで細胞を5分間遠心分離する。その後、上清を取り除き、PBSの500マイクロリットルで細胞を再懸濁します。
細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を介して細胞をペレット化する。その後、上清を吸引する。細胞を含む各チューブに約500マイクロリットルの1%アガロース溶液を加えます。
その後、混合物を上下にピペットして混合する。アガロース細胞溶液が固まった後、チューブに10%NBFの1ミリリットルを加えます。後で、サンプルから NBF を削除します。
カミソリの刃を使用してセルプラグを取り外し、プラグをプラスチック製のティッシュカセットに入れる。自動組織プロセッサでサンプルを一晩処理します。次に、サンプルをパラフィンワックスに埋め込み、標準的な占体法を用いる。
組織アレイ装置を使用して、パラフィンブロックから6ミリメートルのコアを収穫し、空のパラフィンブロックに挿入します。この後、ミクロトームを使用して、新しく作成された細胞株TMAの2つの組織学的セクションを準備する。その後、占いのスライドにセクションをマウントし、それらを脱パラフィン化します。
まず、細胞株TMAの2枚のスライドを自動染色システムにロードします。一方の側を最適な一次抗体希釈で染色し、他方を陰性対照スライドとして残します。両スライドに、核反汚れ、および二次抗体を適用する。
染色プロセスの後、チラミドシグナル増幅試薬を加える。この後、使用された蛍光色素の適切な励起および検出波長を使用して、免疫染色されたスライドをスキャンします。画像解析ソフトウェアを使用して、対象となる細胞区画(核または細胞質のどちらを含むか)を特定し、各ラインの平均蛍光強度(MFI)を定量化します。
どの細胞株が標的タンパク質の最大の存在量を有するかを決定するために、アリコートは、マイクロ遠心分離管に細胞リセートを貴重に調製した。その後、6xラエムリーバッファーの2.5マイクロリットル、および15マイクロリットルに総体積を持って来るために十分なRIPAのリシスバッファーを加えます。次に、SDSページゲルをタンパク質ラダーと、以前に調製したサンプルでロードします。
この後、空の井戸にlaemlyバッファをロードします。青い染料がプレートの底に達するまでゲルを実行します。半乾燥タンパク質の転写を行った後、カミソリの刃を使用して膜を水平に切断し、目的のタンパク質を対照タンパク質から分離する。
メーカーの指示に従ってブロッキングおよび抗体インキュベーションを行います。その後、透明なビニール袋に膜ストリップを入れます。P1000ピペットを使用して、膜をECL混合物で覆います。
次に袋を密封し、暗闇の中で室温で膜を1〜2分間インキュベートします。次に、膜を含むビニール袋をデジタルイメージングプラットフォームに入れます。化学発光と色分けマーカー検出を使用して、膜のさまざまな露出をキャプチャします。
画像解析ソフトウェア、または視覚観察を用いて、どの細胞株が最も標的タンパク質を発現しているかを決定する。この細胞株の連続希釈を免疫化した後、画像解析ソフトウェアを用いて露光画像を開きます。長方形選択ツールを使用して、ゲルの最初のレーンを選択します。
その後、分析に行き、ゲル化し、最初のレーンを選択します。矩形選択ツールを次のレーンに移動してこのプロセスを繰り返し、解析、ゲル化、次のレーンの選択に進みます。次に、分析、ゲル、プロットレーンに移動します。
各ピークのベースを横切って線を引く場合は、直線ツールを使用してバックグラウンドノイズを除去します。次に、杖ツールを使用して各ピークを選択し、結果ウィンドウから各ピークのバンド強度を取得します。密度測定出力を使用して、各一次抗体にロードされた総タンパク質の量に対してバンド強度の散布図を作成します。
次に、最適な適合と視覚観察のラインを使用して、各抗体の線形ダイナミックレンジの位置を決定します。前に示したように、線状範囲内のバンド強度を生じるタンパク質濃度を選択し、そのタンパク質濃度を用いて全ての細胞系ライセートのイムノブロットを実行します。次に、デジタルスキャンで密度測定を行い、抗体ごとに以前に同定された線形範囲内のシグナルを生み出す露出を選択します。
この後、各細胞株の負荷制御バンド強度に対する標的タンパク質バンド強度の比を計算する。最後に、統計ソフトウェアを使用して、IF染色の画像分析から得られた値と、免疫ブロット法から得られた値との間でピアソン相関検定を行う。このプロトコルは、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の相対量を決定するIFの能力を確認するために使用された。
一次抗体の様々な希釈を免疫組織染色剤を用いてヒト扁桃組織で試験した。この実験では、1~50希釈が、バックグラウンドノイズの少ない強い信号を生み出す最適な希釈であると判断されました。この希釈は、免疫蛍光によって細胞株TMAを染色するために使用され、画像解析を用いてBcl-2に起因する細胞質Cy5シグナルを定量化した。
試験細胞株のイムノブロットに基づいて、グランタ-519はBcl-2の最大の豊富さを有していた。次に、グランタ-519溶解物の連続希釈のイムノブロットを使用して、Bcl-2の線形ダイナミックレンジを見つけ、タンパク質GAPDHを制御した。このアッセイにおけるBcl-2のダイナミックレンジは、バンド強度が0近く、7500単位に及んだ。
GAPDH のダイナミック レンジは 3000 ~ 6500 単位です。イムノブロットを、その線形範囲内の曝露で繰り返した。また、GAPDHに対するBcl-2の比率を各細胞株について計算した。
ピアソン相関試験では、免疫ブロッティングからの強度比が、定量IFの強度測定値と強く、肯定的に相関していることを実証した。この手順を試みる間、すべてのバンドがそれぞれの線形範囲内にある最適な露出を見つけるためには、複数の時間ポイントの最終膜を露出することを覚えておくことが重要です。IFプロトコルの定量的性質を検証した後、標的タンパク質が発現する場所などの臨床問題に答えるために日常的に処理された組織サンプルにおいて、多重化IFについて改変することができる。
