이 방법은 일상적으로 처리된 생검 물질에서 바이오마커 단백질을 정량화함으로써 암 병리학 분야에서 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종래의 면역히토케와 관련하여 이 기술의 주요 장점은 객관적이고, 넓은 동적 범위를 가지며, 특정 세포 유형에서 단백질의 정량화를 허용한다는 것이다. 특정 소위 바이오마커 단백질의 존재 또는 부재, 또는 특히, 암 생검 표본에 있는 그 단백질의 상대적인 풍부는 암의 특정 종류의 특정 병리 진단을 만드는 데 매우 유용할 수 있습니다.
그러나 그것은 또한 암 처리에 반응을 예측에 유용할 수 있습니다, 그래서 이 기술은 암을 가진 환자의 진단 그리고 처리 둘 다 관련있는 이유입니다. 이 프로토콜은 주로 면역 형광 기반 분석의 정량적 특성을 검증하기 위해 불멸의 세포주에서 단백질 정량화를 사용하는 방법에 관한 것입니다. 그러나 면역 형광이 쉽게 멀티플렉스 접근 방식에 통합되고 1 차생검 샘플에 적용 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
이 절차를 지원하고 시연하는 것은 기술자인 리 부드로와 운영 책임자인 셰이켈 버크(Shakeel Virk)가 될 것입니다. 분자 병리학을 위한 여왕의 실험실에서 둘 다. 시작하려면, 원심 분리는 5 분 동안 225 Gs에서 50 밀리리터 원추형 튜브에서 이전에 수확 된 세포를 원심 분리합니다.
슈퍼 나탄을 데칭하고, PBS의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단. 그런 다음, 5 분 동안 225 Gs에서 다시 중단 된 세포를 원심 분리합니다. 10%NBF의 10 밀리리터로 세포 펠릿을 중단하십시오.
그런 다음 하룻밤 동안 24 개의 RM에서 로커의 실온에서 세포를 배양합니다. 세포를 고정한 후, 세포를 225 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 제거하고 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.
세포를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿한다. 그런 다음, 슈퍼 나티를 흡인. 세포를 포함하는 각 관에 1%아가로즈 용액의 약 500마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 혼합물을 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 아가로즈 세포 용액이 경화된 후 튜브에 10%NBF의 1밀리리터를 추가합니다. 나중에 샘플에서 NBF를 제거합니다.
면도날을 사용하여 셀 플러그를 제거하고 플러그를 플라스틱 조직 카세트에 넣습니다. 자동화된 조직 프로세서로 밤새 샘플을 처리합니다. 그런 다음 표준 조직학 방법을 사용하여 파라핀 왁스에 샘플을 포함시킴을 포함시킴이에 포함시킴이 에 포함시킴이 에 포함됩니다.
티슈 어레이 기악기를 사용하여 파라핀 블록에서 6mm 코어를 복제하여 빈 파라핀 블록에 삽입합니다. 그 후, 마이크로토메를 사용하여 새로 생성된 세포주 TMA의 두 가지 조직학적 섹션을 준비합니다. 그런 다음 연수 슬라이드에 섹션을 장착하고 분리합니다.
첫째, 셀라인 TMA의 두 슬라이드를 자동화된 염색 시스템에 로드합니다. 최적의 1차 항체 희석을 가진 한쪽에 얼룩을 남기고, 다른 한쪽은 음수 대조군 슬라이드로 남게 한다. 두 슬라이드에 핵 카운터스테인 및 이차 항체를 적용하십시오.
염색 공정 후 티라미드 신호 증폭 시약을 추가합니다. 그 후, 사용된 형광에 대한 적절한 흥분 및 검출 파장을 사용하여 면역스테인드 슬라이드를 스캔한다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 핵 또는 세포질 여부에 관계없이 관심있는 셀룰러 구획을 식별하고 각 라인에 대한 평균 형광 강도 또는 MFI를 정량화합니다.
대상 단백질의 가장 큰 풍부를 가지고 있는 세포주가 있는지 를 결정하기 위해, aliquot는 귀중한 준비된 세포가 미세 원심분리기 튜브로 lysate합니다. 그런 다음 6배 의 2.5 마이크로리터를 추가하고 충분한 RIPA 용해 버퍼를 추가하여 총 부피를 15 마이크로리터로 가져옵니다. 다음으로, 단백질 사다리와 SDS 페이지 젤을 적재하고 이전에 준비된 샘플을 로드합니다.
이 후, 빈 우물에 완충하로드. 파란색 염료가 접시 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 반건조 단백질 전달을 수행한 후 면도날을 사용하여 멤브레인을 수평으로 절단하여 관심 있는 단백질과 관심 있는 단백질을 대조단백질과 분리합니다.
제조 업체지침에 따라 차단 및 항체 배양을 수행합니다. 그런 다음 멤브레인 스트립을 투명 한 비닐 봉지에 넣습니다. P1000 파이펫을 사용하여 ECL 혼합물로 멤브레인을 덮습니다.
그런 다음 가방을 밀봉하고 어둠 속에서 실온에서 멤브레인을 1 ~ 2 분 동안 배양합니다. 다음으로 멤브레인이 들어 있는 비닐 봉지를 디지털 이미징 플랫폼에 배치합니다. 화학 발광 및 색마커 검출을 사용하여 멤브레인의 다양한 노출을 캡처합니다.
이미지 분석 소프트웨어 또는 시각적 관찰을 사용하여 가장 타겟 단백질을 표현하는 세포주가 결정됩니다. 이 셀라인의 직렬 희석을 면역한 후 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 노출 이미지를 엽니다. 직사각형 선택 도구를 사용하여 젤의 첫 번째 차선을 선택합니다.
그런 다음 분석, 젤 및 첫 번째 차선을 선택하십시오. 직사각형 선택 도구를 다음 차선으로 이동하여 이 프로세스를 반복하고 분석, 젤 및 다음 차선을 선택합니다. 다음으로, 분석, 젤 및 플롯 레인으로 이동합니다.
직선 도구를 사용하여 각 피크의 베이스를 가로질러 선을 그려 배경 노이즈를 제거합니다. 그런 다음 지팡이 도구를 사용하여 각 피크를 선택하고 결과 창에서 각 피크의 대역 강도를 가져옵니다. 밀도 측정 출력을 사용하여 각 1차 항체에 대해 로드된 총 단백질의 양에 비해 밴드 강도의 산란플롯을 만듭니다.
그런 다음, 각 항체의 선형 동적 범위의 위치를 결정하기 위해 가장 적합하고 시각적 관찰의 라인을 사용합니다. 선형 범위 내에서 대역 강도를 산출하는 단백질 농도를 선택하고, 이전에 설명한 바와 같이, 그 단백질 농도로 모든 세포주의 면역blot를 수행한다. 다음으로, 디지털 스캔에서 밀도를 수행하여 각 항체에 대해 이전에 확인된 선형 범위 내에서 신호를 산출하는 노출을 선택합니다.
그 후, 각 세포주에 대한 제어 대역 강도를 적재하는 표적 단백질 대역 강도의 비율을 계산한다. 마지막으로 통계 소프트웨어를 사용하여 IF 염색의 이미지 분석에서 얻은 값과 면역 블로팅에서 얻은 값 간의 Pearson 상관 관계 테스트를 수행합니다. 이 프로토콜은 항 세포 단백질 Bcl-2의 상대적 양을 결정하는 IF의 능력을 확인하기 위해 사용되었다.
1 차적인 항체의 변화하는 희석은 면역 조직학 얼룩을 가진 인간 편도선 조직에 시험되었다. 이 실험의 경우 1~50개의 희석이 배경 잡음이 거의 없는 강력한 신호를 산출한 최적의 희석으로 결정되었습니다. 이러한 희석은 면역형광에 의해 세포주 TMA를 염색하는 데 사용되었고, 영상 분석은 Bcl-2에 기인하는 세포질 Cy5 신호를 정량화하기 위해 사용되었다.
모든 테스트 된 세포주를 위한 면역 블롯을 기반으로, 그랜타-519Bcl-2의 가장 큰 풍부했다. 그란타-519 용액의 직렬 희석의 면역블롯은 Bcl-2의 선형 동적 범위를 찾아단백질 GAPDH를 조절하는 데 사용되었다. 이 분석기에서 Bcl-2의 다이나믹 레인지는 거의 0의 밴드 강도에서 7500 단위에 이르기까지 다양했습니다.
GAPDH의 다이나믹 범위는 3000대에서 6500대까지 다양했다. 면역블롯은 선형 범위 내에서 노출과 함께 반복되었다. 그리고 Bcl-2 대 GAPDH의 비율은 각 세포주에 대해 계산되었다.
Pearson 상관 관계 테스트는 면역 blotting의 강도 비율이 양적 IF의 강도 측정과 강하게 긍정적으로 상관관계가 있음을 입증했습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 모든 밴드가 각각의 선형 범위 내에 있는 최적의 노출을 찾기 위해 여러 시간 지점에 대한 최종 멤브레인을 노출하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. IF 프로토콜의 정량적 특성을 검증한 후, 표적 단백질이 발현되는 곳과 같은 임상 질문에 답하기 위해 일상적으로 처리된 조직 샘플에서 멀티플렉스 IF를 위해 수정될 수 있다.
