Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области патологии рака, путем количественной оценки биомаркеров белков из регулярно обрабатываемого материала биопсии. Основными преимуществами этого метода по отношению к обычной иммуногистохимии, являются то, что она объективна, имеет широкий динамический диапазон и позволяет количественно оценить белки в конкретных типах клеток. Наличие или отсутствие некоторых так называемых белков биомаркеров, или, в частности, относительное изобилие этих белков в образцах биопсии рака может быть очень полезным в принятии конкретной патологической диагностики конкретных видов рака.
Но это также может быть полезно в прогнозировании реакции на лечение рака, поэтому этот метод имеет отношение как к диагностике и лечению больных раком. Этот протокол главным образом о как использовать квантификацию протеина в immortalized линиях клетки для того чтобы проверить количественный характер анализа основанного immunofluorescence. Но важно отметить, что иммунофторесценция может быть легко включена в мультиплексный подход и применена к первичным образцам биопсии.
Помогать и демонстрировать эту процедуру будут Ли Boudreau, техник, и Shakeel Virk, директор по операциям. Оба из Королевской лаборатории молекулярной патологии. Для начала, центрифуга ранее собранных клеток в 50 миллилитров конической трубки на 225 Gs в течение пяти минут.
Декант супернатант, и повторное распределение клеточных гранул в 10 миллилитров PBS. Затем центрифуга повторного перерасхода клеток на 225 Gs в течение пяти минут. Приостановить ячейку гранулы с 10 миллилитров 10%NBF.
Затем инкубировать клетки при комнатной температуре на рокер на 24 RPMs ночь. После фиксации клеток, центрифуга клеток на 225 Gs в течение пяти минут. Затем удалите супернатант и повторно наполнить клетки в 500 микролитров PBS.
Перенесите клетки в 1,5 миллилитр микроцентрифугную трубку и гранулировать клетки через центрифугирование. Затем, аспирировать супернатант. Добавьте около 500 микролитров раствора 1%agarose к каждой трубке, содержащей клетки.
Затем, пипетка смесь вверх и вниз, чтобы смешать. После того, как раствор агарозы затвердеет, добавьте в трубки один миллилитр 10% NBF. Позже удалите NBF из образцов.
Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить вилку клетки, и поместите вилку в кассету пластиковой ткани. Обработать образцы на ночь с помощью автоматизированного процессора тканей. Затем встраивайте образцы в парафиновый воск, используя стандартные гистологические методы.
Используя инструмент массивера тканей, урожай дублировать 6 миллиметровых ядер от парафина блока, и вставить их в пустой парафин блока. После этого используйте микротом для подготовки двух гистологических секций недавно созданной клеточной линии TMA. Затем смонтируйте секции на гистологическом слайде и депараффинизируйте их.
Во-первых, загрузите два слайда клеточной линии TMA в автоматизированную систему окрашивания. Пятно одной стороны с оптимальным первичным разбавлением антител, оставляя другую в качестве отрицательного контроля слайда. На оба слайда нанесите ядерный счетчик и вторичные антитела.
После процесса окрашивания добавьте реагенты усиления сигнала тирамида. После этого сканируйте иммуноинкрементные слайды, используя соответствующие возбуждения и обнаружения длин волн для флюорофоров, которые были использованы. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для определения интереса к сотовому отсеку, будь то ядро или цитоплазма, и количественно оценить средняю интенсивность флуоресценции, или МФО, для каждой линии.
Чтобы определить, какая линия клеток имеет наибольшее изобилие целевого белка, aliquot драгоценно подготовленные клетки лизат в микроцентрифуг труб. Затем добавьте 2,5 микролитров буфера 6x laemly и достаточно буфера лиза RIPA, чтобы довести общий объем до 15 микролитров. Затем загрузите гель страницы SDS с белковой лестницей и ранее подготовленными образцами.
После этого загрузите laemly буфер в пустые колодцы. Запустите гель, пока синий краситель не достигнет нижней части пластины. После выполнения полусухой передачи белка, используйте лезвие бритвы, чтобы сократить мембрану горизонтально, чтобы отделить белок интереса от контрольного белка.
Выполните блокирование и инкубации антител в соответствии с инструкциями производителей. Затем поместите мембранные полоски в четкий полиэтиленовый пакет. Используйте пипетку P1000 для покрытия мембран смесью ECL.
Затем запечатать мешок, и инкубировать мембраны при комнатной температуре в темноте в течение одной-двух минут. Затем поместите полиэтиленовый пакет, содержащий мембраны, в цифровую платформу визуализации. Используйте хемилюминесценцию и обнаружение колоритных маркеров для захвата различных экспозиций мембраны.
Используя программное обеспечение для анализа изображений или визуальное наблюдение, определите, какая линия клеток выражает наиболее целевой белок. После иммуноблотинга последовательного разбавления этой клеточной линии откройте изображения экспозиции с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Используйте прямоугольный инструмент выбора, чтобы выбрать первую полосу геля.
Затем перейдите к анализу, гели, и выбрать первую полосу. Повторите этот процесс, перемещая инструмент прямоугольных выборов на следующую полосу, и перейдите к анализу, гелям и выберите следующую полосу движения. Далее перейдите на анализ, гели и сюжетные дорожки.
Используйте инструмент прямой линии, чтобы нарисовать линии через основания каждого пика, чтобы удалить фоновый шум. Затем используйте инструмент палочки, чтобы выбрать каждый пик, и получить интенсивность полосы каждого пика из окна результатов. Создайте рассеяние интенсивности полосы по сравнению с количеством общего белка, загруженного для каждого первичного антитела с использованием денситометрии выход.
Затем используйте линию наилучшего соответствия и визуального наблюдения, чтобы определить расположение линейного динамического диапазона каждого антитела. Выберите концентрацию белка, которая дает интенсивность полосы в линейном диапазоне, и выполните иммуноблот всей клеточной линии лисирует с этой концентрацией белка, как пооявляло ранее. Затем выполните денситометрию на цифровом сканировании, выбрав экспозиции, которые дают сигналы в пределах ранее выявленных линейных диапазонов для каждого антитела.
После этого вычислите соотношение интенсивности целевой белковой полосы к интенсивности нагрузок контрольной полосы для каждой клеточной линии. Наконец, используйте статистическое программное обеспечение для выполнения теста корреляции Пирсон между значениями, полученными в результате анализа изображений окрашивания IF, и теми, которые получены от иммуноблоттинга. Этот протокол был использован для подтверждения способности ИФ определить относительное количество антиапоптотического белка Bcl-2.
Различные разбавления первичных антител были протестированы на ткани миндалин человека с иммуногистаминные пятна. В ходе этого эксперимента было определено, что разбавление от одного до 50 является оптимальным разбавлением, которое дает сильный сигнал с небольшим фоновым шумом. Это разбавление было использовано для окрашивания клеточной линии TMA иммунофлюоресценцией, а анализ изображений использовался для количественной оценки цитоплазмического сигнала Cy5, приписываемого Bcl-2.
Основываясь на иммуноблоте для всех проверенных клеточных линий, Granta-519 имел наибольшее изобилие Bcl-2. Иммуноблот серийного разбавления лизата Granta-519 затем использовался для найдите линейный динамический диапазон Bcl-2 и контроль белка GAPDH. Динамический диапазон для Bcl-2 в этом анализе колебался от интенсивности полосы почти 0, до 7500 единиц.
Динамический диапазон для GAPDH варьировался от 3000 до 6500 единиц. Иммунобло был повторен с воздействиями в этом линейном диапазоне. И соотношение Bcl-2 к GAPDH было рассчитано для каждой линии ячейки.
Тест корреляции Пирсона показал, что коэффициенты интенсивности иммуноблоттинга сильно и положительно коррелируют с показателями интенсивности от количественных IF. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы разоблачить окончательную мембрану для нескольких точек времени, для того, чтобы найти оптимальную экспозицию, где все полосы находятся в пределах своих линейных диапазонов. После проверки количественного характера протокола IF, он может быть изменен для мультиплекса IF, в обычно обработанных образцах тканей, чтобы ответить на клинические вопросы, такие как, где целевой белок выражается.
