機能性超音波は、生きているげっ歯類の脳の脳の血液量のマッピングを可能にする新しい神経画像のモダリティです。超高速面波画像を使用して、我々は比類のない特別な一時的な分解能と感度で脳全体の血行力学応答を測定することができます。このプロトコルは、麻酔と覚醒動物実験の両方のために、マウスで経頭蓋機能超音波画像診断を行う方法を説明します。
FMRIなどの他の全脳機能イメージング技術と比較して、機能的超音波は高い可搬性、使いやすさを提供し、目を覚まし、自由に動く被験者の実験を可能にし、麻酔バイアスを回避し、行動研究を可能にする。最近まで、FUSイメージングは超音波の専門家とのコラボレーションでのみ使用されていました。現在、この技術は、市販のスキャナと前臨床脳イメージングのための専用ソフトウェアのおかげで、広い神経科学コミュニティに利用可能であり、FUSは超音波の背景なしではかなり使いやすくなっています。
麻酔付きイメージングセッションでは、角膜損傷を避けるためにマウスの目に眼軟膏を塗布し、振戦を使用してマウスヘッドを剃ります。数分後に脱毛クリームを塗り、すすいでください。ヘアが完全に削除されるまで、この操作を繰り返します。
心電図記録のために手足に皮下ピンを挿入し、頭部に遠心超音波ゲルを置く。目覚めのマウスの実験では、頭部固定のために予備手術が必要です。麻酔マウスと立体性フレームを摂氏37度の加熱パッドの上に置きます。
目に保護ジェルを塗布し、皮下に26ゲージ針を使用して頭皮の下にリドカインを投与し、数分待ちます。後頭部骨の後ろから鼻骨の始まりまで矢状縫合糸に続いて切開し、手術用はさみを使って両半球の皮膚を切除する。1%のヨウ素溶液で頭蓋骨をきれいにし、残りの骨膜を取り除きます。
ヘッドプレートをテンプレートとして使用し、頭蓋骨に2つの穴をマークして固定ネジを配置します。ヘッドプレートをネジに置き、インプラントの良好なグリップを維持するために、歯のセメントを使用して、フレームの前後のネジとヘッドプレートを固定します。セメントが乾燥した後、立体性フレームから動物を取り除き、アトミペゾールのキログラムあたり1ミリグラムの皮下注射を介して麻酔を逆にします。
術後の痛みのために予防的なメロキシカムを投与する。保護のためにヘッドプレートの上に磁気3Dプリントキャップを置き、マウスがモバイルホームケージへの習慣の開始前に4〜6日間回復できるようにします。数時間加熱パッドの回復ケージに動物を置き、その後、ごみの仲間と自宅のケージにマウスを戻します。
4日目と5日目のポストリカバリでは、マウスをモバイルホームケージに繰り返しクランプし、頭の固定時間を5分から30分まで徐々に増やします。マウスを習慣化するために、画像窓に生理食い物と超音波ゲルを塗布します。6日目の復旧後にこのプロセスを繰り返します。
ソフトウェアを起動し、実験セッションを作成します。ナビゲーションキーボードを使用して超音波プローブの位置を調整するには、移動プローブメニューに移動します。ライブビューの取得を開始し、必要に応じて、動物の脳の血液量、またはCBVのリアルタイムイメージングを介してプローブの位置を調整します。
画像の中央に脳を揃え、画像化パラメータを最適化して、最高の信号対ノイズ比をキャプチャします。取得ソフトウェアの[Angio 3D]オプションを開きます。プリセットパネルで、最初のスライス、最後のスライス、ステップサイズのスキャンパラメータを調整して、脳全体をスキャンして取得を開始します。
取得したソフトウェアを開いたまま、データ分析と可視化のためにソフトウェアを起動し、Angio 3Dスキャンをロードします。3つのビューパネルを使用して取得ボリュームをナビゲートし、コロナスキャン方向、後部または姿勢前部を選択します。脳登録パネルに移動し、登録プロセスのマウス参照テンプレートを読み込みます。
全自動または手動登録モードを使用して、アレン マウス共通座標フレームワークでスキャンを登録します。Angio 3D スキャンと参照テンプレートの重ね合わせを確認するか、またはアトラスマネージャパネルを使用してスキャンとアレン参照アトラスの重ね合わせを確認します。登録を BPS ファイルとして保存します。
ICOスタジオソフトウェアで、血管造影スキャンとそのBPSファイルがロードされていることを確認してください。脳ナビゲーションパネルに移動します。[アトラスマネージャ]パネルで、親子ツリーナビゲーターを使用して、マウスのアレン・ブレイン・アトラスをナビゲートします。
解剖学的ターゲット領域を見つけ、それらを選択して3つのビューでスキャンに重ね合わせる。3 つのビュー パネルで対象領域を視覚化し、対象領域を含むコロナ位置に 2 つのマーカーを手動で設定して、実験の対象領域と重なるイメージング平面を選択します。脳位置決めシステム(BPS)をクリックして、プローブの位置に対応する結果のモーター座標を抽出し、対象となる平面を画像化します。
アンジオスキャンから計算された画像のプレビューを確認します。ICOスキャンソフトウェアで、プローブの位置パネルに入り、BPS座標を入力してクリックし、抽出された座標を適用して、プローブがターゲットのイメージングプレーン上を移動して整列させます。ライブビュー取得を実行し、現在の撮像面が予測に対応していることを確認します。
刺激の時間、興味刺激時間、繰り返し回数を含む刺激シーケンスを事前定義します。取得の合計時間、ポジション数、およびポジション間のデッドタイムを定義して、3D FUS シーケンスを実行します。TTL入力を介して集録システムと同期する自動刺激の場合、取得を開始する前に、トリグインオプションを選択します。
ICO studioソフトウェアで取得を開き、アクティベーションマップメニューに入り、開始時間と終了時間でアクティベーションパターンフィールドを入力し、アクティベーションマップを計算します。視覚化の表示パラメータを調整し、オフライン解析用の H5 ファイルとしてアクティベーション マップをエクスポートします。取得の合計時間、撮像平面の位置数、および位置間のデッドタイムを定義して、3D FUS シーケンスを実行します。
取得を保存し、ICOスタジオソフトウェアにロードします。必要に応じて、BPS ファイルとアレン マウス脳協調フレームワークを読み込みます。アトラスマネージャで、対象地域としてアトラスのリージョンを選択します。
機能伝導度メニューを入力し、希望する領域と ROI マネージャを選択します。結果を接続マトリックスまたはシードベースの相関マップとして視覚化し、必要に応じて帯域幅フィルターを選択して調整し、統計分析用の相関結果をエクスポートします。このプロトコルは、マウス脳における脳血血力学的変化の3D定量に使用された。
ウィスカ刺激は、感性刺激誘発応答の例として選択した。有意な活性化は、マウスの血行力学的応答関数を使用して、一般的な線形モデル(GLM)の解像度で決定された。試験期間は760秒で、60秒のベースライン、80秒の刺激、60秒の回復時間が5回繰り返された。
逆側の一次体性感覚皮質のボクセル賢明な時間経過を使用して、バレルフィールド領域、またはS1BFは、ベースラインと比較してCBVの15〜20%の増加を明らかにした。同じパラダイムは、ICOスキャンの目覚めのプリセットを使用して、モバイルホームケージ内のヘッド固定動作マウスに適用されました。複数のウィスカー刺激実験後の活性化マップを以下に示します。
有意な活性化は、デフォルトのマウス血行力学的応答関数を使用してGLMの解像度で決定された。一時的な相関は、ケタミンキシラジン麻酔マウスにおける3D脳領域間の低周波自発的なCBV変動を正規化した。種子ベースの分析と背部海馬は、右海馬と左海馬の間の有意な半球間伝導性だけでなく、より深いレトロ海馬領域およびpiriform礼儀を明らかにした。
S1BFで選択されたシード領域も対称相関パターンをもたらした。実験を成功させるための重要なポイントは、動物の調製、特に麻酔動物を含む実験のための麻酔のレベルと、覚醒動物の実験における頭蓋骨の保護である。米国が睡眠、学習、行動に関する基本的な質問だけでなく、創薬のための機能的な接続性の薬理学的変調を扱う目を覚ます動物の重要な脳機能を研究することを可能にした場合。
