このビデオで示されているプロトコルは、真菌性催眠形態形成に対する腸代謝産物の役割を理解することを可能にする。このex vivo技術は、多かれ少なかれ、インビトロ研究が複製できない方法で真菌催眠形態形成を研究するための腸の最も近い近似値である。この方法は、他の腸内病原体における腸代謝産物の役割を研究するために適用することができる。
オートクレーブ殺菌された鋭利なはさみおよび鉗子を使用してマウスを解剖する。安楽死後、腹部を露出させるためにすべての手足を固定することによって、動物を解剖面に固定します。70%エタノールで腹部領域をスプレーし、毛皮が鉗子、はさみ、または腸の切片に付着するのを防ぎます。
鉗子を使用して腹部の基部の皮膚をつまんで持ち上げ、盲腸や腸壁を穿刺しないように注意して皮膚と下層筋膜を通して小さな切開を作成します。このカットを腹腔を部分的に露出させた胸部に伸ばし、両側の最初の切開の時点から切り取り、上方および横方向に延びる。これらのフラップを横に引き、解剖表面に固定して腹腔を完全に露出させます。
はさみを使用して胃よりも優れた切り傷を作り、大腸の遠位領域で鉗子でGI管を抽出し、最大量の腸内含有量の収集を確実にします。GI管を取り外す場合は、個々のコンポーネントが破裂しないように注意してください。胃、小腸、盲腸、大腸を近位および遠位の端で分離する。
各セクションから腸の内容物のコレクションのために、遠位端で単一の切開を行い、その後、手動で鉗子と1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に腸の内容を排出します。エキビボアッセイのためにマイナス80°Cでサンプルを保管してください。C.albicans SC5314の新鮮な文化をYPD寒天プレートにストリークし、摂氏30度で一晩インキュベートします。
翌日、2つまたは3つの中規模の個々のコロニーを選び、PBSの1ミリリットルでそれらを再中断します。冷凍庫から冷凍腸の内容物を取り出し、摂氏25度で解凍します。約150ミリグラムの腸内の内容物を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、150マイクロリットルのPBSで再中断します。
サンプルを30秒間高速で渦を出して腸内の内容物を均質化し、室温で約1分間座るようにします。ホモゲン化物を1,000倍Gで3分間遠心し、その上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、破片を転写しないように注意します。遠心分離を繰り返した後、上清にC.albicans接種物の10マイクロリットルを加え、よく混ぜ、サンプルを摂氏37度で4〜5時間インキュベートします。
C.albicansに対する外因性代謝物の効果をテストするには、代謝産物の所望の濃度を腸内含量およびPBS混合物に加え、その後、30秒間高速で試料を渦液し、室温で10分間座らせ、前に述べたように遠心分離および接種を行う。真菌細胞培養物をG1,000倍2分間遠心し、上清を捨てる。サンプルを100マイクロリットルの2%PFAで15分間固定し、遠心分離を繰り返し上清を捨てます。
原稿の指示に従ってPBSの1ミリリットルでサンプルを2回洗浄し、その後、ポリクローナルC.albicans抗体でPBSの100マイクロリットルの室温でサンプルを30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSでさらに3回洗浄し、薄暗い光の中で作業して光の漂白を避けます。暗い部屋では、抗ウサギIgGアレクサフルオール488抗体を1〜500希釈で含有するPBSの100マイクロリットルで15分間室温でサンプルをインキュベートします。
PBSの1ミリリットルでサンプルを3回洗浄した後、PBSの100マイクロリットルでそれを再懸濁し、イメージングのために96ウェルプレートに移します。20Xと40X対物レンズと緑色蛍光タンパク質フィルターを使用して、蛍光イメージング顕微鏡で真菌細胞を画像化します。C.albicansが胃から採取した腸ホモゲネート抽出物でex vivoを成長させると、未治療のコントロールおよび抗生物質処理マウスの小腸および大腸は、一般的に酵母形態で発症する。
しかし、抗生物質処理マウスからcecal抽出物で増殖すると、C.albicansは容易に酵母およびヒファの形態をもたらす形態形成を受ける。これは、抗生物質治療がC.Albicansの催眠形態形成を誘発するcecal環境の変化を引き起こすことを示している。抗生物質処理マウスのcecalホモゲン酸グルコースの外因性添加は、大規模なヒファル発達ex vivoを示した。
これらの結果は、抗生物質処理マウスのセカールホモゲネートに戻る腸代謝産物の添加が、C.albicansの形態形成を差し分化することを示唆している。このプロトコルを試みるとき、腸の内容の希釈の最適化は、破片の収集なしに腸代謝物の十分な収集を保証することに留意してください。2対1のメディアから腸へのコンテンツ希釈を超え、可能であればより低い希釈を目指してください。
この技術は、腸内の特定の代謝産物が催眠発達にどのように影響するかを探求するために現在使用されており、研究者は真菌病原発に対する腸代謝産物の役割をよりよく理解することができます。
