このプロトコルは、RNAの完全性を維持するのに役立つ死後の人間の脳組織に対する色素ベースの視覚化の代わりに染色を含まない視覚化方法を利用するため、重要です。RNAの保存は、このプロトコルでは、死後の人間の脳組織だけでなく、RNase活性が高い他の組織タイプにも有用であるため、大きな利点です。まず、冷凍庫から組織を取り出し、ドライアイスの上に置いてクライオスタットに運びます。
清潔なブラシ、チャック、組織をクライオスタットに少なくとも20分間入れ、最適な温度に達するようにします。二重チャンバーと標本保持温度を持つクライオスタットの場合は、物体温度をマイナス16°C、チャンバー温度をマイナス18°Cに設定します。クライオスタットの断面の厚さを14マイクロメートル、トリム厚さを30マイクロメートルに設定します。
次に、RNase除染剤と70%エタノールの1対1の混合物でステージを洗浄し、凍結を防ぎます。新しい使い捨て可能なクライオスタットブレードを入手し、RNase除染機で清掃してください。クリーニングしたブレードをステージ上のブレードホルダーに置きます。
次に、RNase除染器でアンチロールプレートを洗浄します。洗浄したプレートをステージに取り付け、ブレードとアンチロールプレートがクライオスタットの温度になるまで少なくとも20分待ちます。まず、切片のために小さな組織を切断し、セクションが約95%小脳皮質であることを確認します。
残りの組織をドライアイスに戻すか、氷を氷上にマイナス80度で戻します。次に、ゆっくりと円の動きでチャックの上にOCTをゆっくりと追加し始めます。チャックを覆う高さ約3ミリメートルのマウントがあるまでOTCの層を構築します。
OCT が部分的に凍結しているのに、中央に液体が残っている場合は、ティッシュをマウントの上に置きます。組織が完全に凍結するまで1〜2分間OCTの上に座らせます。その後、凍結したOCTと組織を用いてチャックをクライオスタット切断アームに移します。
切断ブレードでフラッシュされるように組織を調整し、組織を切断アームに20分間座らせて新しい温度に調整します。最も重要なステップは、必要な限り、組織がクライオスタット切断アームに順応できるようにすることです。組織が細断された場合、プルキンエ細胞の可視化は非常に困難になります。
私は、組織がより速く順応できるように、より小さく、より薄い組織片を使用することをお勧めします。この後、ゆっくりと組織をブレードに近づけます。組織がブレードに到達したら、トリミングプロセスを開始します。
皮質層が見えるまで、組織を2〜3回トリミングします。次に、反ロールプレートをクライオスタットブレードのすぐ上に配置し、位置合わせします。厚さ14マイクロメートルの4~6個のセクションをカットし、適切に切断されたセクションがアンチロールプレートの下で平らになることに注意してください。
カットセクションをクライオスタットステージを横に水平に配置します。スライドを角度にして、すべての組織片を同時に拾います。組織を切り離した直後に、スライドをスライドホルダーに70%エタノールを氷の上に2分間置きます。
氷上に95%エタノールを入れ、スライドを45秒間スライドホルダーに移します。次に、スライドをスライドホルダに100%エタノールを室温で2分間置きます。スライドを室温でキシレンナンバーワンを含むスライドホルダーに3回浸します。
次に、スライドをスライドホルダに、室温で2本のキシレンを室温に5分間置きます。滑り台をきれいな煙のフードに置き、少なくとも30分間空気乾燥させます。スライドを保管する場合は、それぞれを別の50ミリリットルチューブに入れ、チューブをマイナス80°Cの冷凍庫に最大7日間置きます。
まず、RNase除染器を使用して、顕微鏡ステージとキャップコレクションアームを清掃します。手袋をはめた手で、スライドを顕微鏡の上に置き、コレクションアームに500マイクロリットルの不透明なキャップを置きます。低倍率で、不透明なキャップを小脳組織の上に揃え、キャップがアイピースに視覚化された領域全体を覆うようにします。
小脳層を視覚化するために5倍から10倍の目標を使用してください。分子層と顆粒細胞層が交差する部分の上にカーソルを置きます。40倍の倍率に移動し、purkinje細胞を視覚化します。
次に、キャプチャを開始します。マイクロディセクショの後にRNA採取を開始するには、キャップを上に向けて不透明キャップに50マイクロリットルの細胞ライシスバッファーを追加します。慎重にキャップの上にチューブを閉じ、テキストプロトコルで概説されているように、コレクションに進みます。
このプロトコルでは、新鮮な、凍結された、事後分析、ヒトの脳組織は、UVレーザー捕捉マイクロ解剖のために調製される。割り当てられた描画時間におけるクライオスタットの断面化に続いて、小脳の細胞層は5回、10倍の対物レンズで容易に見える。ここで見られるように、適切なキシレンインキュベーションは、組織が暗くなり、エタノール単独よりも細胞層をより良く線引く原因となります。
レーザー捕獲顕微鏡で切断するとき、40回の対物レンズは、周囲の組織ではなく、プルキンエ細胞のみを捕捉するために必要とされる。ここで見られるように、キシレンの適切なインキュベーションは、エタノール固定単独と比較して、高品質の形態学的に無傷の画像を生成する。不透明なキャップのカバースリップ能力は、他のプロトコルが液体充填キャップを利用している間にテストされ、これらのキャップは組織の視覚化を減少させ、得られた画像を顕微鏡下で粒状および虹色にすることができる。
しかし、不透明なキャップを通して視覚化すると、滑らかな組織の外観が柔らかく、よりシャープになります。低電力で高出力での切除されたプルキンエ細胞の代表的な画像は、プルキンエ細胞体のみの正確な除去を示す。この後、その後のRNAシーケンシングのために高品質のRnaseが得られます。
6つの代表的なサンプルがRNA抽出を受け、14マイクロリットルのRnaseフリー水で再懸濁され、6つのサンプルすべてが8以上のRNA完全性番号を持つ高品質のRNAを製造しました。覚えておくべきことは、組織の品質がすべてであるということです。切断とスライドの配置でさえ、このプロトコルを作るか、または壊すでしょう。
この手順に従って、RNAまたはDNAを調査する方法を実行することができ、具体的にはRNAの遺伝子発現の調査を行いますが、遺伝子調節に関する他の質問も調査できます。この方法は、目的の細胞の同定のために抗原または色素特異的試薬を使用する必要がない特異的な線引き形態を有する任意の組織タイプに適用することができる。この技術が、エッセンシャル振戦の遺伝学や振戦表現型の他の疾患を理解するのに役立つことを願っています。
このプロトコルで使用される最も危険な化学物質はキシレンです。それは、煙のフードで適切に処理され、適切に処分され、スライドは、オープンスペースで使用されるまで十分に乾燥させておくべきである。また、ヒトのサンプルを扱う際には、生物危険廃棄物の管理、安全性を活用する必要があります。
