このプロトコルは、タンパク質およびペプチドの部位特異的バイオコンジュゲーションのための新しい試薬であるPODSの合成および応用について説明する。この技術は、従来のマレイミド-チオールベースのバイオコンジュゲーションに対する顕著な改善を表しています。この手順の最大の利点は、試薬が作られるシンプルさです。
この方法により、試薬を事実上あらゆる実験室で合成することができます。丸底フラスコ10ミリリットルで、アミノフェニルオキサジアゾールチオールの100ミリグラムを3ミリリットルのメタノールに溶解する。溶液に、ジイソプロピレチルアミンの360マイクロリットルと磁気攪拌棒を加えます。
ラスコをゴム栓で密封し、室温で10分間攪拌します。1ミリリットルのガラスシリンジを使用して、ゴム栓に穴を開け、32マイクロリットルのヨードメタンを混合物に素早く加えます。混合物を室温で45分間反応させます。
25ミリリットルの丸底フラスコで、ボック保護カルボン酸の387ミリグラムをジクロロメタンの10ミリリットルに溶解する。溶液に、ジイソプロピレチルアミン480マイクロリットル、EDCIの264ミリグラム、アニリンの200ミリグラム、および磁気攪拌棒を加える。フラスコをガラスストッパーで密封し、反応を室温で5日間かき混ぜるようにします。
反応が完了したら、反応混合物をセパロール漏斗に移し、5ミリリットルの1モル塩酸で3回洗浄する。有機相を収集し、セパレーター漏斗に転送します。その後、有機相を炭酸ナトリウム1モルで洗い、続いて水を洗います。
次に、有機相を回収し、硫酸マグネシウムを添加して、水の痕跡を取り除きます。その後、中程度のガラスフリットを使用して混合物をフィルタリングします。ロータリーエバポレーターを使用して、低圧で揮発性溶媒を除去し、オフホワイトの固体を得る。
これに続いて、単離された固体を酢酸エチル10ミリリットルで再溶解する。その後、シクロヘキサンの30ミリリットルの徐々に添加を介して製品を沈殿させ.中ガラスフリットを用いて溶液をろ過し、白色粉末としてカルバメート製品を得る。
丸底フラスコ10ミリリットルで、カルバメートの30ミリグラムをジクロロメタンの4ミリリットルに溶解する。混合物にゆっくりと70%m-クロロペル安息香酸の49ミリグラムと磁気攪拌棒を加え、グラスストッパーでフラスコを密封します。溶液を室温で一晩撹拌し、最終的に黄色の混合物を生成します。
翌日、混合物をセパレーター漏斗に移します。その後、0.1モルの水酸化ナトリウムと水で混合物を洗います。有機相を収集し、水の痕跡を除去するために硫酸マグネシウムを追加します。
その後、中程度のガラスフリットを使用して混合物をフィルタリングします。25ミリリットルの丸底フラスコで、カルバメートの30ミリグラムをジクロロメタンの2ミリリットルに溶解する。混合物に磁気攪拌棒を追加します。
そして、トリフルオロ酢酸の400マイクロリットルとガラスストッパーでフラスコを密封。その後、反応混合物を室温で3時間かき混ぜます。反応が完了したら、ロータリーエバポレーターを使用して室温で減圧下で揮発性物質を除去し、油性残渣を得る。
油性残渣を7ミリリットルの水に溶かします。そして、セパレーター漏斗に転送します。4ミリリットルの酢酸エチルで水溶液を3回洗います。
1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで、10ミリグラムのPODSと300マイクロリットルのジメチルスルホキシドを溶解します。その後、26マイクロリットルのN、N-ジイソプロピレチルアミンを溶液に加える。100マイクロリットルのジメチルスルホキシドにDOTA NCSの15.2ミリグラムを溶解し、その溶液をPODS溶液と組み合わせます。
マイクロ遠心チューブを密封し、反応を室温で一晩インキュベートできるようにします。次に、低タンパク質結合性1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに859マイクロリットルのPBSを用いたトラスツズマブストック溶液の61マイクロリットルを希釈する。この混合物に、6.7マイクロリットルのTCEPの作りたての10ミリモル溶液を水中に加える。
反応混合物に1ミリグラム1ミリリットルのPODS-DOTA溶液の73マイクロリットルを加える。最後に、マイクロ遠心チューブを密封し、室温で2時間溶液をインキュベートします。PODSの合成は強く、信頼できる。
アミノフェニルオキサジアゾールチオールの脱蛋白および置換は、定量収量でチオエーテル1を与えた。チオエーテル1とボック保護カルボン酸の結紮は、化合物2を55%収率で得た。酸化は90%の収率で化合物3を与えた。
そして、ボック保護群の除去は98%の収率でPODSを生み出した。各製品の身元は、プロトンNMR、カーボンNMR、および高解像度MSを介して確認された。キレート子DOTAのアイソチオシアネート担体変異体をPODSのペンダントアミンに結合し、75%の収率で二官能キレートを得た。製品の身元は、プロトンNMR、カーボンNMR、および高解像度MSを介して確認された。HER2標的抗体トラスツズマブに対するPODS-DOTAの部位選択的バイオコンジュゲーションをここに示す。
抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合を選択的に減少させ、その後、抗体をPODS-DOTAと共にインキュベートし、DOTAを有する免疫コンジュゲートに80%の収率を与えた。MALDI-TOF分析は、抗体あたり1.8 DOTAの標識の程度を明らかにしました。これは、ヒト、ヒト化、およびキメラIgG1抗体の範囲にわたって一貫したままです。
しかし、同じ条件で、マウスIgG1抗体に対して1.5の標識がある免疫コンジュゲートが生成されます。この化合物の光感度のために、ホイルで覆われた容器内のすべての反応を維持することが重要です。これにより、製品の全体的な収率が増加します。
このプロトコルはPODS-DOTAの合成を記述するが、同様の手順は、フッ素、毒素、および他のキレート剤を含む潜在的な貨物の広い範囲に適用することができる。この方法は、幅広い分野で使用できる、明確に定義された、均質で、高い安定性の免疫コンジュゲートの構築を容易にします。この実験のステップ1で追加されたヨードメタンは有害な影響を及ぼす可能性があるため、ヒュームフードで使用する必要があることを覚えておくことが重要です。
