Este protocolo descreve a síntese e a aplicação do PODS, um novo reagente para a bioconjugação específica do local de proteínas e peptídeos. Esta tecnologia representa uma melhoria acentuada em relação às bioconjugações tradicionais baseadas em maleimida-thiol. A maior vantagem deste procedimento é a simplicidade com que o reagente é feito.
O método permite que o reagente seja sintetizado em praticamente qualquer laboratório. Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, dissolva 100 miligramas do aminofenil oxadiazole thiol em três mililitros de metanol. À solução, adicione 360 microliters de diisopropiletilamina e uma barra de agitação magnética.
Sele o frasco com uma rolha de borracha e mexa a solução por 10 minutos em temperatura ambiente. Usando uma seringa de vidro de um mililitro, faça um furo através da rolha de borracha e adicione rapidamente 32 microliters de iodometano à mistura. Deixe a mistura reagir por 45 minutos em temperatura ambiente.
Em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, dissolva 387 miligramas do ácido carboxílico protegido pelo bocha em 10 mililitros de diclorometano. À solução, adicione 480 microlitadores de diisopropiletilamina, 264 miligramas de EDCI, 200 miligramas da anilina e uma barra de agitação magnética. Sele o frasco com uma rolha de vidro e deixe a reação agitar por cinco dias à temperatura ambiente.
Uma vez que a reação esteja completa, transfira a mistura de reação para um funil separador, e lave três vezes com cinco mililitros de ácido clorídrico de um molar. Recolher a fase orgânica e transferi-la para o funil separador. Em seguida, lave a fase orgânica com carbonato de sódio de um molar seguido de água.
Em seguida, colete a fase orgânica e adicione sulfato de magnésio para remover quaisquer vestígios de água. Em seguida, filtre a mistura usando um frito de vidro médio. Usando um evaporador rotativo, remova os solventes voláteis sob pressão reduzida para pagar um sólido off-white.
Na sequência, ressola o sólido isolado em 10 mililitros de acetato etílico. Em seguida, precipitar o produto através da adição gradual de 30 mililitros de ciclohexano. Filtre a solução usando um frit de vidro médio para obter o produto carbamate como pó branco.
Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, dissolva 30 miligramas do carbamate em quatro mililitros de diclorometano. Adicione lentamente 49 miligramas de ácido cloroperbenómico de 70%m e uma barra de agitação magnética à mistura, e sele o frasco com uma rolha de vidro. Mexa a solução durante a noite à temperatura ambiente, resultando em uma mistura amarela.
No dia seguinte, transfira a mistura para um funil separador. Em seguida, lave a mistura com hidróxido de sódio de 0,1 molar seguido de água. Colete a fase orgânica e adicione sulfato de magnésio para remover quaisquer vestígios de água.
Em seguida, filtre a mistura usando um frito de vidro médio. Em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, dissolva 30 miligramas do carbamate em dois mililitros de diclorometano. Adicione uma barra de mexiça magnética à mistura.
E 400 microliters de ácido trifluoroacético e selar o frasco com uma rolha de vidro. Em seguida, mexa a mistura de reação à temperatura ambiente por três horas. Uma vez que a reação esteja completa, remova os voláteis sob pressão reduzida à temperatura ambiente usando um evaporador rotativo para obter um resíduo oleoso.
Dissolva o resíduo oleoso em sete mililitros de água. E transferir para um funil separador. Lave a solução aquosa três vezes com quatro mililitros de acetato etílico.
Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, dissolva 10 miligramas de PODS e 300 microliters de sulfóxido de dimetil. Em seguida, adicione 26 microlitadores de N, N-diisopropiletilamina à solução. Dissolva 15,2 miligramas de DOTA NCS em 100 microliters de sulfóxido de dimetil e combine a solução com a solução PODS.
Sele o tubo de microcentrifuuge e permita que a reação incubar durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, diluir 61 microliters de uma solução de estoque trastuzumabe com 859 microliters de PBS em um tubo de microcentrifuge de baixa proteína de ligação de 1,5 mililitro. Nessa mistura, adicione 6,7 microliters de uma solução recém-feita de 10 mililitros de TCEP na água.
Adicione 73 microliters de uma solução PODS-DOTA de um miligrama à mistura de reação. Por fim, sele o tubo de microcentrifuuagem e incuba a solução por duas horas em temperatura ambiente. A síntese do PODS é robusta e confiável.
A desproteína e a substituição do aminofenil oxadiazole thiol proporcionou outra em rendimento quantitativo. A ligadura de tither um e o ácido carboxílico protegido por bocha produziu composto dois em rendimento de 55%. Oxidação proporcionada composto três em rendimento de 90%.
E a remoção do grupo de proteção de bocs rendeu PODS em rendimento de 98%. A identidade de cada produto foi confirmada via NMR de próton, NMR de carbono e MS de alta resolução. Uma variante isothiocianato do dota chelator foi acoplado ao pingente amina de PODS para obter o chelator bifunctional em rendimento de 75%. A identidade do produto foi confirmada via NMR de próton, NMR de carbono e MS de alta resolução. A bioconjugação seletiva do pods-DOTA para o trastuzumabe de anticorpos de alvo HER2 é mostrada aqui.
As ligações dissulfetos da região da dobradiça do anticorpo foram seletivamente reduzidas, e o anticorpo foi então incubado com PODS-DOTA para pagar ao imunoconjugado portador de DOTA um rendimento de 80%. A análise MALDI-TOF revelou um grau de rotulagem de 1,8 DOTA por anticorpo. O que permanece consistente em uma gama de anticorpos IgG1 humanos, humanizados e quiméricos.
No entanto, as mesmas condições produzem imunoconjugados com um grau de rotulagem de 1,5 para anticorpos murine IgG1. Devido à sensibilidade à luz deste composto, é importante manter todas as reações em vasos cobertos de papel alumínio. Isso aumentará o rendimento global do produto.
Embora este protocolo descreva a síntese de PODS-DOTA, um procedimento semelhante pode ser aplicado a uma ampla gama de cargas potenciais, incluindo fluoroforos, toxinas e outros queladores. Este método facilitará a construção de imunoconjugados bem definidos, homogêneos e altamente estáveis que podem ser usados em uma ampla variedade de campos. É importante lembrar que o iodometano adicionado na primeira etapa deste experimento pode ter efeitos nocivos e, portanto, deve ser usado em um capuz de fumaça.
