Bu protokol, protein ve peptidlerin bölgeye özgü biyokonjugasyonu için yeni bir reaktif olan PODS'un sentezini ve uygulanmasını açıklar. Bu teknoloji geleneksel maleimid-tiol tabanlı biyokonjugasyonlar üzerinde belirgin bir gelişme temsil eder. Bu yordamın en büyük avantajı reaktif yapılır basitlik.
Yöntem reaktif hemen hemen her laboratuvarda sentezlenebilir sağlar. 10 mililitrelik yuvarlak alt şişede, metanol üç mililitre aminofenil oksadiazol tiyol 100 miligram çözünür. Çözeltiye 360 mikrolitre diisopropiletilemin ve manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.
Şişeyi kauçuk bir durdurucuyla kapatın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çözeltiyi karıştırın. Bir mililitrelik cam şırınga kullanarak, kauçuk durdurucu ile bir delik poke ve hızlı bir şekilde karışıma iyoometantan 32 mikrolitre ekleyin. Karışımın oda sıcaklığında 45 dakika tepki göstermesine izin verin.
25 mililitrelik yuvarlak alt şişede, 10 mililitre diklorometan da boc korumalı karboksilik asit 387 miligram çözünür. Çözeltiye 480 mikrolitre diisopropiletilin, 264 miligram EDCI, 200 miligram anilin ve manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Şişeyi cam durdurucuyla kapatın ve reaksiyonun oda sıcaklığında beş gün boyunca soğumasını bekleyin.
Reaksiyon tamamlandıktan sonra reaksiyon karışımını ayırıcı bir huniye aktarın ve beş mililitre tek molar hidroklorik asitle üç kez yıkayın. Organik faz toplamak ve ayırıcı huni aktarın. Daha sonra organik fazı tek azılı sodyum karbonat ve ardından su ile yıkayın.
Sonra, organik faz toplamak ve su herhangi bir iz kaldırmak için magnezyum sülfat ekleyin. Sonra orta cam frit kullanarak karışımı filtre. Bir döner evaporatör kullanarak, beyaz olmayan bir katı satın almak için azaltılmış basınç altında uçucu çözücüler çıkarın.
Bunu takiben, etil asetat 10 mililitre izole katı yeniden çözünür. Sonra sikloheksane 30 mililitre kademeli ilave yoluyla ürün çökelti. Beyaz toz olarak karbamate ürün elde etmek için orta cam frit kullanarak çözelti filtre.
10 mililitrelik yuvarlak alt şişede, 4 mililitre diklorometan halinde 30 miligram karbamatei çözün. Yavaşça karışıma % 70 m-kloroperbenzoik asit ve manyetik karıştırma çubuğu 49 miligram ekleyin ve bir cam stoper ile şişe mühür. Sonuçta sarı bir karışım veren, oda sıcaklığında bir gecede çözelti karıştırın.
Ertesi gün, karışımı ayırıcı bir huniye aktarın. Daha sonra karışımı 0.1-molar sodyum hidroksit ve ardından su ile yıkayın. Organik faz toplamak ve su herhangi bir iz kaldırmak için magnezyum sülfat ekleyin.
Sonra orta cam frit kullanarak karışımı filtre. 25 mililitrelik yuvarlak alt şişede, iki mililitre diklorometan halinde 30 miligram karbamatei çözün. Karışıma manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.
Ve 400 mikrolitre trifloroasetik asit ve şişeyi cam durdurucuyla kapatın. Daha sonra reaksiyon karışımını oda sıcaklığında üç saat karıştırın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, yağlı bir kalıntı elde etmek için bir döner evaporatör kullanarak oda sıcaklığında azaltılmış basınç altında uçucu kaldırın.
Yedi mililitre suda yağlı kalıntıyı çözün. Ve ayırıcı bir huniye aktar. Sulu çözeltiyi dört mililitre etil asetat ile üç kez yıkayın.
1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 10 miligram PODS ve 300 mikrolitre dimetil sülfoksit çözün. Daha sonra çözeltiye 26 mikrolitre N, N-diisopropiletilemin ekleyin. 100 mikrolitre dimetil sülfoksitte 15,2 miligram DOTA NCS çözün ve çözeltiyi PODS çözeltisi ile birleştirin.
Mikrosantrifüj tüpünü kapatın ve oda sıcaklığında bir gecede inkübe reaksiyonuna izin verin. Sonra, düşük protein bağlayıcı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp PBS 859 mikrolitre ile bir trastuzumab stok çözeltisi seyreltik 61 mikrolitre. Bu karışıma, suda TCEP'in taze yapılmış 10 milimolar çözeltisinin 6,7 mikrolitresini ekleyin.
Reaksiyon karışımına mililitre başına bir miligramlık PODS-DOTA çözeltisinin 73 mikrolitresini ekleyin. Son olarak, mikrosantrifüj tüp mühür ve oda sıcaklığında iki saat boyunca çözelti kuluçka. PODS sentezi sağlam ve güvenilirdir.
Deproteinasyon ve aminofenil oksadiazol tiol ikame kantitatif verim tiyoether bir tanınan. Tiyoether bir ve boc korumalı karboksilik asit ligasyonu bileşik iki% 55 verim verdi. Oksidasyon bileşik üç% 90 verim verdi.
Bocs-koruma grubunun kaldırılması %98 verimle PODS'u vermiştir. Her ürünün kimliği proton NMR, karbon NMR ve yüksek çözünürlüklü MS ile doğrulandı. Şelator DOTA bir isotiyosiyanat taşıyan varyantı% 75 verim iki fonksiyonlu şelatör elde etmek için PODS kolye amin ile birleştiğinde. Ürünün kimliği proton NMR, karbon NMR ve yüksek çözünürlüklü MS ile doğrulandı. PODS-DOTA'nın HER2 hedefli antikor trastuzumab'a site seçici biyokonjugasyonu burada gösterilmiştir.
Antikor menteşe bölgesinin disülfür bağlantıları seçici olarak azaltıldı ve antikor daha sonra DOTA taşıyan immünkonjugate%80 verimi sağlamak için PODS-DOTA ile kuluçkaya yatırıldı. MALDI-TOF analizinde antikor başına 1.8 DOTA etiketleme derecesi saptandı. Hangi insan, insanlaşmış ve şeymerik IgG1 antikorları bir dizi tutarlı kalır.
Ancak, aynı koşullar murine IgG1 antikorları için 1.5 etiketleme derecesi ile immünkonjugates üretmek. Bu bileşiğin ışık hassasiyeti nedeniyle, folyo kaplı kaplarda tüm reaksiyonları tutmak önemlidir. Bu, ürünün toplam verimini artıracaktır.
Bu protokol PODS-DOTA sentezini açıklarken, benzer bir prosedür floroforlar, toksinler ve diğer şelatörler de dahil olmak üzere çok çeşitli potansiyel yüklere uygulanabilir. Bu yöntem, çok çeşitli alanlarda kullanılabilecek iyi tanımlanmış, homojen ve son derece kararlı immünkonjugates'in yapımını kolaylaştıracaktır. Bu deneyin birinci adımında eklenen iyodotan'ın zararlı etkileri olabileceğini ve bu nedenle duman kaputunda kullanılması gerektiğini unutmamak gerekir.
