Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

これらのプロトコルのための基礎を設定するのに参加している、Amayra · エルナンデス ベガとフィリップ ・ アレクサンドル ・ Pouille に感謝します。我々 はまた、IBMB PCB、ザビエル ・ エステバン、継続的な支援のための研究室のメンバーから分子イメージング プラットフォームを感謝します。ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ、DGI と EMB と DN に経済産業省、競争のスペインから Consolider 助成金の連結グループ プログラムはこの仕事を支えた。

下記載されているすべてのプロトコル手順我々 の機関の動物のケアのガイドラインに従ってください。
1. ゼブラフィッシュ文化
<ol><li>繁殖し、標準的な条件下で大人のゼブラフィッシュを維持します。 注: AB と TL の野生型胚は、本研究に使用されました。</li>
	<li>胚を収集し、E3 胚中24の 28.5 ° C でそれらを育てます。上記の19として形態によるとステージします。</li>
</ol>2. 原子間力顕微鏡
<ol><li>手動で dechorionate は、(個々 の興味に応じてさまざまな年齢層) のゼブラフィッシュ胚を上演しました。(材料の表を参照してください) 2 つの細くてシャープな鉗子で絨毛を削除します。<ol>
<li>1 つの鉗子を用いた絨毛膜をグリップし、他の鉗子でそれで涙。そして、涙とは逆の地域で絨毛膜を持ち、優しく開口胚を押します。</li>
		<li>8 X と 50 X 倍率の調整範囲を解剖顕微鏡の下で dechorionation を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>原子間力顕微鏡の胚をマウントします。
	<ol>
<li>胚中 2% アガロース溶液を準備し、これで 35 mm のペトリ皿を入力します。固めること。アガロース ベッド細い鉗子で 1.5 mm (2 回胚のサイズ) と約 350 μ m 深さ (半分胚のサイズ) の小さい穴を作る。</li>
		<li>Agarose のレイヤーで行われたポークで胚を置き、彼らが 0.5% 低のソリューションの周りを広めることで適所融解胚中アガロースを保証します。ちょうど穴にそれらを保護する胚の周りこの溶液を注ぐ。</li>
		<li>低融点アガロースは、室温で固化、前に afm プローブの関心領域が (図 1 a) 上向きに直面しているような方法で胚を回転します。</li>
	</ol></li>
	<li>原子間力顕微鏡による胎児を調べる
	<ol>
<li>画像反転原子間力顕微鏡で 20 × 対物を用いたペトリ皿で胚を見つけて (材料表25参照) 室温 (23-24 ° C)。 注: 胚は、胚の中に浸漬し、アガロース ベッドに添付に生きて保持されます。</li>
		<li>0.01 N/m. カンチレバー振動のピーク-ピーク振幅を 5 μ m と 1 hz の周波数に設定する名目のバネ定数のカンチレバーに接続されている直径 4.5 μ m の球状のポリスチレン ビーズを用いたキャストの胚の卵黄細胞表面をプローブします。</li>
		<li>ルーチンは、データの平均値として別の位置といくつかの胚は、テストする各地域のデータを収集します。 注: 良い出発点は、プローブ原子間力顕微鏡顕微鏡の XY の圧電アクチュエータを用いた片持ち梁の位置を制御する中央、10 μ x 10 μ m の正方形のコーナーをある 5 つの位置にです。画像とデータ収集は、胚あたり約 20 分を取った。胚の卵黄細胞表面のさまざまな地域のデータを記録、例えば植物極または EVL セル余白 (図 1 bと1 C) に近い別の地域のみ行えます異なる向きで異なる供試体を用いた。</li>
	</ol></li>
	<li>力を計算します。
	<ol>
<li>顕微鏡制御ソフトウェアと光てこ法による圧電アクチュエータとそのたわみ (d) 象限フォト ダイオードを用いた結合のひずみゲージ センサー AFM カンチレバー (z) の鉛直変位の測定 (材料の表を参照してください。25)。</li>
		<li>ガラス基板の裸地域から収集したデータから得られた d z 曲線の傾きを使用すると、フォト ダイオードの信号とカンチレバーのたわみ量 (d) との相関を調整します。 注: 測定の鉛直変位に等しいカンチレバーたわみ量と斜面光てこ26の偏向感度を表します。</li>
		<li>熱的ゆらぎから片持ちバネ定数 (k) 前述したように27を推測します。</li>
		<li>として (h) サンプルのインデントを計算します。 h = (z - zc) -(d - dオフ)          (1) 注: ここでzcは接触点の位置、dをフォト ダイオードのオフセット。</li>
		<li>片持梁としての力 (F) を計算します。 F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>粘性液体を囲む張力 Tcの弾性層から成る液体バルーン モデルの観点から野の張力を計算します。このモデルで (胎児の大きさ) と比較すると小さいインデントに力比例して増加として4,28 。 F = 4 π Tc[(Rb / Re) +1)] h (3) 注: ここでRbはビーズの半径、 Reは胚の半径。ゼブラフィッシュ胚の胚 (400 μ m) の半径は 2 桁のビーズ (2.25 μ m) のそれより大きいと、この方程式として近似できます。 F = 4 π Tc h (4)<ol>
<li>緊張力-インデント (F・h) の計算の 5 つの異なる胚卵黄細胞地域ごとのカーブ ポイントの測定。</li>
		<li>各F用hカーブの非線型最小二乗フィッティングTcを計算します。統計分析、表層張力Tcの計算は異なるF-h曲線から平均する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>低振幅を適用することによって大脳皮質の粘弾性特性 (レオロジー) を測定 (100 nm) AFM 中周波振動周波数の異なる25の正弦波で構成されます。
	<ol>
<li>として力押込み曲線から周波数領域における効果的な複素弾性率g*(ƒ)を計算します。 g *(f) = [F(f)/ h(f)]- ifb (5) ここでiは虚数単位、力とインデントの周波数 (f) スペクトルF(f)、 h(f)。bは表面に適用される振動から抽出したカンチレバーの粘性抵抗の補正です。</li>
		<li>実数と虚数の部分に別のg*(ƒ) : g *(Ƒ) = g' (f) + ig」(f)          (6) em > g'(f) は弾性、弾性エネルギーの測定の格納し振動のサイクルごとに回復します。g' (f) は消費エネルギーに占める粘性係数。</li>
		<li>固体状のインデックスを提供する損失のタンジェントを計算 (< 1) または液体状 (> 1) 材料の挙動として。 g'(f)/ g' (f)          (7) 注: このタイプの測定、それはパラメーターを抽出することが可能か粘性を示すとどのように弾性検出された材料であります。Bは少し表面にカンチレバーの端までの距離に依存、 gの非常に低い値を与えて ´´ 卵黄による展示 ( 2 D 図を下記を参照) を細胞、 bの小さな変化でごくわずかな影響があります。測定値29。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 粒子追跡のレオロジー
<ol><li>
卵黄細胞に粒子マイクロインジェクションを実行します。
	<ol>
<li>水平マイクロ ピペットの引き手とキャピラリーのホウケイ酸ガラス (材料の表を参照) を使用して合わせたマイクロニードルを製作します。<ol>
<li>引き手設定を使用した 10 cm の長さ、0.58 mm 内径 1.00 mm の外径を持ちますマイクロニードルを準備: 圧力: 500;熱: 510;プル: 65;速度: 25;時間: 50。</li>
		</ol>
</li>
		<li>カスタム作られた金型 (材料の表を参照) を用いた胚中ベッドで 1% の agarose のストレート インデント レーンを作成してシャーレ、インジェクションのプレートを準備します。<ol>
<li>金型を逆さま回すと液体 agarose のゲルの上に置いて、ゲルは固化後、金型を削除します。1.2 倍の倍率で解剖顕微鏡の下で agarose の金型によって作られた溝に胚をピペットします。 注: 幅と金型の設計を自ら揃えるため胚を有効にします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>注入前に (表面張力は、胚/絨毛膜を注入後、取り外しに針に付着防止) 注入を促進する媒体をほぼ完全に削除します。</li>
		<li>蛍光ナノ粒子を microinject (半径、= 100 nm、材料表を参照してください) 胚の卵黄細胞 (図 3 a) の植物の一部で水 (1:1, 000) で希釈しました。</li>
		<li>精密マニピュレーターにピペットを調整し、時間と圧力のコントロール (材料の表を参照) と自動マイクロインジェクターとビーズを注入します。10 ~ 20 psi 圧力を設定します。</li>
		<li>ビーズ ソリューションを注入前にキャリブレーションを注入する量 (0.5 nL) 1 x 0.01 mm ステージ マイクロメータをもつガラスシリンジで配信される液滴のサイズを測定することによって (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>部屋の温度で行われる注射の中に胚を視覚化する解剖顕微鏡で 1.6 倍の倍率を採用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
熱変動を記録することによって、卵黄の粘弾性挙動を評価します。
	<ol>
<li>Dechorionate として、microinjected の胚手順 2.1 と融解胚中溶液中 30 ° C でポイント agarose 0.5% 低に埋め込むその後、ガラス底板 (材料の表を参照してください) に転送して、オリエントし、agarose がまだ液体、coverslip に向かってそれらをプッシュします。 注: agarose が室温で固化、胚がイメージを作成する準備が。</li>
		<li>マイクロインジェクション後 2 h 倒立顕微鏡のステージ上にガラスの底板にマウントされた胚を配置します。26 のナノ粒子の画像をキャプチャ標準商業顕微鏡のソフトウェアを用いた倒立顕微鏡に室温で 63 × 対物と 25 の Hz のサンプリング レートで s (ピクセル サイズ = 166 nm、40 ms 毎の画像)。</li>
		<li>パーティクルの重心の位置を計算し、オープン ソース ソフトウェア ImageJ (図 3 b) の TrackMate プラグインで時間をかけて彼らの軌跡を定義します。</li>
		<li>特注ソフトウェア6,30として各粒子の二次元平均二乗変位 (MSD) を計算します。 < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>          (8) 注: ここでtは経過時間とのタイムラグです。純粋な液体で MSD 増加反比例ストークス-アインシュタインの関係により粘度 (ν)。 < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/6πνa、          (9) ここでTは絶対温度です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. 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著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係を宣言します。

ここで、ふせ中ゼブラフィッシュ卵黄細胞のいくつかの生体力学的パラメーターと材料特性容易に推定できるナノ粒子と AFM レオロジーで紹介します。
AFM が生理的条件4,5,25,28の細胞や組織のレオロジー機能を取得するために採用されている、我々 が原子間力顕微鏡をそのま?...

地形形成過程の力学的制御の基になる物理的な原則は、主として定義されていません。分子・細胞レベルの生体力学的研究がかなりの勢いを収集している組織・個体レベルでの生体力学的パラメーターの探査はその初期の段階で。流体の回帰1またはビデオ力顕微鏡2レーザー顕微鏡3、または解離細胞4のより少なく嵌入的原子間力顕微鏡 (AFM) 中のアクティブおよびパッシブ力を区別するために研究者を許可するまたは生体内で5やナノ粒子のマイクロレオロジー簡易6組織の力学的特性と応答の期待を許可します。
原子間力顕微鏡、表面粗さ、接触時に片持ち梁先端の変形からのプローブ表面7遵守の解決高原子分解能三次元地形手法です。原子間力顕微鏡を用いた異なる方法論は、摩擦、接着力、多様な材料の粘弾性特性の測定を含む表面の特性を調査するために開発されています。最近、原子間力顕微鏡は、試料の物性に関する情報を取得する強力なツールとして浮上しています。特に、原子間力顕微鏡の単一セルから知られている曲げ定数8のカンチレバーに接続されているマイクロ チップの振動のインデントを適用することによって複素すり弾性率抽出できます非侵襲的。これにより生じる力を推測できます。しかし、AFM は一意ではありません、異なる方法論は個々 の細胞からレオロジー データと機械的性質を抽出できるように (例えば、マイクロ ピペット吸引9、ねじれフローサイトメトリー (MTC)10、磁気または一軸引張11をのテスト)。
まだ、これらの新規方法論の複雑な地形形成過程への応用は簡単ではありません。萌芽期ティッシュの機械的性質を決定する際に直面する主要な課題、ソフト (mm μ m)、小 (102 - 104 Pa 範囲) と粘弾性 (時間依存現象に上昇を与えている) 自然素材12。したがって、胚や発展途上の生物の特定のケースに機械的性質 (剛性、粘度、接着性) の定量手法を適応する重要です。2 つの重要な問題が研究開発にレオロジー的アプローチを分析する際に考慮取られる必要: 侵入の干渉を避けるために、簡単にアクセスを提供します。このシナリオではマイクロ ピペット吸引、MTC、および引張試験は、制限を表わします。最初のケースでは、セルに苦しむ高変形はその生理学的・機械的性質9を変更可能性があります。2 番目のケースで適用応力がローカルの骨格を変形させるように基板に実験的組織を堅持する必要可能性がありますも細胞のアクティブ化の状態と、それ故に、機械的な機能10代で効果をご紹介.最後に、一軸引張アプローチは生物とアクセシビリティ11開発の幾何学によって限られます。
原子間力顕微鏡は、ことができます面倒なサンプル準備もせず、自然の環境で直接試料の研究発達過程の研究に適しているようです。さらに、萌芽期ティッシュの解離は一般的に困難である、原子間力顕微鏡プローブの縮小サイズ、メディア (水溶液や非水溶媒)、サンプル温度または化学の種類の選択の制限で汎用性の高いサンプルの組成物。原子間力顕微鏡は、大規模なドメインに適用され、時間スケールに十分な汎用性発達段階や生理的条件で組織の材料特性を取得するために採用されています。全くネイティブ組織機械的性質も取得した15されて動脈13または骨14は地形のポイントのビューから、強のようないくつかのケースで研究されているようです。地形は、アフリカツメガエル16の形態形成における細胞の配列などの視覚化を許可する生きている胚で検討されています。最後に、包括的なサンプル準備のプロトコルは、異なる発達過程における力学的パラメーターを決定する開発されています。ニワトリ胚の消化管11; ネイティブ非固定ティッシュ セクションのナノインデンテーション マップが生成されています。gastrulating ゼブラフィッシュ胚4; から分離された個々 の外胚葉、中胚葉、内胚葉前駆細胞の接着性と機械的性質を取得胚盤葉上層と鳥類胚17から植に原始線条の剛性測定アフリカツメガエル5の胎生期脳で直接定義されている剛性勾配の異なるパターン。
萌芽期の開発を探索する AFM を適用するため大幅な質的な飛躍は、簡単なアクセス可能な地形形成過程に近づいてから来るかもしれない。ゼブラフィッシュふせは不可欠であり、保存されたイベントは、さまざまな組織が、数時間で、胚の拡張を直接に制限された球状空間で調整。ゼブラフィッシュふせ (球面ステージ) の発症時は、包み込むレイヤー (EVL)、細胞の表層は大規模な卵黄の合胞体細胞の上に座って胚の動物極を中心とした割球の半球形キャップをカバーしています。ふせは、EVL、皮質植物区拡大の奥の細胞 (DCs)、胚と卵黄の周り合胞体卵黄細胞 (E YSL) の外部の層で構成されています。ふせ、EVL、植物極18,19,20DCs の閉鎖を終了します。方法と場所ふせ中に生じるし、どのように彼らは大域結合が明確ではない1,21。
ここで詳細にゼブラフィッシュ卵黄でふせ進行中に受動的な機械的組織プロパティが生体内で細胞を推論する AFM を適用する方法を示します。これを行うには、AFM カンチレバー プローブのように接続されている小さな微粒子を採用しました。これは非一様卵黄細胞表面での張力勾配とそのダイナミクスを時間をかけて勉強するに正確なローカルの情報の検索をことができます。代替 AFM アプローチ ウェッジ カンチレバー22を使用するものなど、ないローカルなレンダリング データも正確に。カンチレバーの終わりにサンプル サイズより大きいくさびを接着剤に非常に慎重に操作スキルが必要、くさびのテクニックは胚をプロービングのため適していません (~ 倍カンチレバーの長さより大きい) 力学。
モデリングと定性的および定量的な方法で細胞の粘弾性特性を特徴付ける、バイオメカニクスの改善された理解が可能です。生体力学的視点からそれは、ふせと張力測定と力学、原子間力顕微鏡; で抽出することができますだけでなく需要知識を理解しておく必要従って組織の生物物理学的特性に関する情報の必要性があります。この情報を抽出するには、23さまざまな生理学的な条件の下で種類の異なる細胞を特徴付けるために長年にわたってさまざまな細胞レオロジー技術きた。原子間力顕微鏡には、MTC、光ピンセット (OT) が含まれます。これらのメソッドは、ただし、証明されている胚または器官のスケールで解析は不十分。代わりに、我々 は正常に体内のレオロジー測定用ナノ粒子追跡マイクロレオロジー簡易6を適応しています。この手法は、個々 の粒子のブラウン運動の変位を分析し、ローカル マイクロメカニックス プロパティを推測します。
一緒に原子間力顕微鏡とナノ粒子のレオロジーは、ふせ時に皮質の引張力学の定義と卵黄の内部の機械的性質を許可します。この情報は、完全に、EVL の変形応答の相違の結果として成長する異方性応力 E YSL 皮質の等方性アクトミオシン収縮する卵黄細胞質層 (YCL) は欠かせないモデルを支持します。EVL とふせの進行1の方向の正味の移動。

<table><tbody><tr><td>Inverted optical microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td></tr><tr><td>Atomic force microscope (AFM)</td><td>Custom made</td><td>-</td><td>Any commercialized AFM could be employed</td></tr><tr><td>Inverted Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Casting embryos</td></tr><tr><td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Securing embryos</td></tr><tr><td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td></tr><tr><td>Dumont 5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>1.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; cantilever</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &amp;micro;m diameter and k=0.01 N/m</td></tr><tr><td>Fluorescent nanoparticles</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,</td><td>For tracking nanorheology</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Borosilicate capillary glass</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Fabricating tailored microneedles</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulating the micropipette</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Controlling injection time and pressure</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualization of the embryos during injection</td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyzing AFM and particle tracking data</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB and TL wild type</td><td>-</td><td>Strains employed for embryo collection</td></tr><tr><td>Glass Bottom Plates</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Measuring injection volume</td></tr></tbody></table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

組織の進化の時空間的組織に直接因子の解明は、開発の研究の主な目的の 1 つです。さまざまな命題は、異なる発達と形成過程における時空間組織の細胞や組織の機械的性質の理解に重要な貢献をされていると主張します。ただし、材料特性と体内張力パラメーターを測定する信頼性とアクセス ツールの不足、これらの仮説の検証は困難でした。原子間力顕微鏡 (AFM) と粒子追跡ふせ中にそのままゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞の機械的性質を数値化の目的と方法をご紹介します。ふせはその研究は胚の透明性によって促進される保存の初期発達過程です。これらのメソッドが実装する単純な信頼性、および広く適用以来、彼らは組織の力学に影響を与えることができる侵入の介入を克服します。単純な戦略は、標本、AFM 記録、およびナノ粒子注入の取り付けと追跡の適用されました。このアプローチでは、これらのメソッドは他の発達度や生物に容易に適応になります。

表層張力測定 各測定ポイントの 5 つの力 (F z) 曲線は AFM による 1 Hz で 5 μ m のピーク-ピーク振幅と片持ち梁を立ち上げることにより買収された (速度 = 10 μ m/s) 〜 2 μ m の最大インデントまで。この手順は、20 分未満を取っていたし、ふせ進行を受けませんでした。各実験条件は、少なくとも 5 胚でテストされました。
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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

材料特性と体内張力パラメーターを測定するツールの欠如は、開発中に自分の役割を検証するを防ぎます。原子間力顕微鏡 (AFM) とふせ中そのままゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞の機械的な機能を定量化するナノ粒子の追跡を採用しました。これらのメソッドは、信頼性が高く、広く適用できる侵入の介入を避けることです。

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K ビュー.  Consejo Superior de Investigaciones Científicas. 材料特性と体内張力パラメーターを測定するツールの欠如は、開発中に自分の役割を検証するを防ぎます。原子間力顕微鏡 (AFM) とふせ中そのままゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞の機械的な機能を定量化するナノ粒子の追跡を採用しました。これらのメソッドは、信頼性が高く、広く適用できる侵入の介入を避けることです。

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

発生生物学

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

神経科学

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ胚のための洗練されたマルチビューライトシート顕微鏡法

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:高解像度マルチビューライトシート顕微鏡のためのゼブラフィッシュ胚のマウント戦略 — イメージングと画像再構成の技術

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

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共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

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初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

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