このプロトコルを使用すると、フラバノンからかなりの数のフラボノールを1つのポットで簡単に生成できます。この技術は、人手と時間を節約し、非常に費用対効果が高く、制御が容易であるため、巨大な工業化の可能性を秘めています。はい、この方法は、他の二次代謝産物の経済生産に関する洞察を提供することができますが、それに適用すると、いくつかの変更が必要です。
彼は通常、何も得られないか、非常に低い収量を得るでしょう。私のアドバイスは、氷上の組換え酵素を処理し、酵素のストック溶液に10%グリセリンを加える方法です。これは、視覚的なデモンストレーションを通じてのみ、実験の成功に影響を与える重要な詳細と真実を新しい手で理解できるからです。
まずバッファを準備します。適量のTRIS塩基、アスコルビン酸ナトリウム、αケトグルタル酸を脱イオン水に溶解し、ピペット適量のグリセロールを溶液に溶解して、2倍の合成バッファーを作ります。ピペットを使用して塩酸を加えてpHを7.2に調整し、脱イオン水を加えて体積を調整します。
将来の使用のために摂氏4度で2倍の合成バッファーを保管してください。次いで、脱イオン水に硫酸ヘプタハイドレートを溶解して100回ストック液を作ります。フラボノイドをメタノールに溶解させて25ミリモルフラボノイドのストック溶液を作り、マイナス20°Cで保存します。
最も重要なステップは、合成システムを設定することです。フラバノンからフラバノールを製造する合成システムをセットアップするには、まず、この表に記載されている試薬に従って合成系を2ミリリットルチューブで調製します。開いたチューブを摂氏40度、600rpmで40分間揺れるヒートブロックに入れます。
その後、酢酸10マイクロリットル、酢酸エチル100マイクロリットルを添加して反応を終了する。2時間後、ピペットを使用して、上部の有機相を1.5ミリリットルチューブにトランファーし、室温で空気乾燥するためにフードにチューブを入れます。TLC分析を行うために、まずフードからチューブを取り出し、フラバノイド粉末を160マイクロリットルのメタノールでチューブに再溶解します。
25ミリモルフラボノイドストック溶液をメタノールで希釈することにより、シリアル濃度の本格的なフラボノイドサンプルを調製します。再溶解した反応試料の1マイクロリットル、および本物のフラボノイド試料の1マイクロリットルをポリアミドプレートにロードする。同じプレート上の本物のフラボノイドの他の濃度にも同じことを行います。
次にヒュームフードに、サンプルを装填したプレートを、溶媒系で満たされたクロマトグラフィーシリンダーに入れます。プレートをシリンダーの底に取り付け、20分間、溶媒系でプレートを実行します。空気はプレートを室温で乾燥させます。
噴霧器ボトルで、塩化アルミニウムの1%エタノール溶液でプレートをスプレーし、続いて室温で30分間空気乾燥を行います。254ナノメートルでUV光の下でプレート上のスポットを視覚化し、画像を撮り、コンピュータ上でソフトウェアImageJを開きます。ファイルをクリックして開き、分析する画像を開きます。
ImageJ ユーザーインターフェイスで、最も長方形の選択ツールをクリックします。イメージの ROI の概要をマウスで囲み、1 を押して最初の ROI にラベルを付けます。マウスを右に移動して四角形の選択を移動し、2 番目の ROI にラベルを付けるには 2 を押します。
2 を押して、他のすべての ROI にラベルを付ける場合は、この手順を繰り返します。3 を押すと、ポップアップ ウィンドウにすべての ROI のプロファイル プロットが生成されます。次に、直線選択ツールを使用して、対象の各ピークに対して閉じた領域を定義するように、ベースラインをドロップします。
ImageJ ユーザーインターフェイスの対応するアイコンをクリックして、杖ツールをアクティブにします。ピークの内側をクリックすると、ポップアップ ウィンドウにすべてのピークの結果が表示されます。次に、Excelで、ポップアップウィンドウから対応するフラボノイド濃度に対してグレーの値をプロットし、本格的なフラボノイドのTLCベースの標準曲線を作ります。
次に、このプロトコルで生成された目的のフラボノイドの収率を、得られた式に従って計算する。0.45マイクロメートルと0.22マイクロメートルのフィルターを通して各サンプルを連続して処理するためにシリンジを使用してください。サンプルを吸引ノズルを通してHPLC-MSシステムにロードし、C18カラムを使用して30°Cでサンプルを分離します。
1分間に1ミリリットルのアセチルニトリルを水中に10~85体積%の勾配で1ミリリットルでエルプルし、200~800ナノメートルの溶出性の吸光度を監視します。LC-MS解析は、摂氏300度で毎分10リットルの乾燥窒素流を摂氏250度で1分あたり10リットルのシースガスフローで、250°Cのソフトウェアを使用してデータを収集する、負イオンモードで行います。単一波長クロマトグラフを抽出するには、定性解析プログラムを開き、ファイルをクリックしてデータファイルを開きます。
開いているデータ ファイル ウィンドウで分析するファイルを選択し、[開く] をクリックしてファイルを開きます。クロマトグラムの結果ウィンドウでマウスを右クリックし、ポップアップメニューでクロマトグラムを抽出します。タイプリストで、他のクロマトグラムをクリックします。
検出器コンボボックスで、DAD1を選択し、次に[大丈夫]をクリックして、HPLCの結果をクロマトグラム結果ウィンドウに表示します。クロマトグラムの結果ウィンドウの上部にドッキングされている手動統合アイコンをクリックします。マウスを使用した手動統合解析に必要なピークのベースラインを描画します。
[ビュー]、統合ピークリストをクリックして結果を表示します。ピーク領域の結果をExcelにコピーし、本物のフラボノイドのHPLCベースの標準曲線を対応するフラボノイド濃度に対してプロットし、次いで、このプロトコルで生成された目的のフラボノイドの収率を、得られた式に従って計算する。その後、同じ手順を繰り返して単一波長クロマトグラムを抽出し、フラボノイド化合物の正確な質量のMSデータを分析します。
クロマトグラム結果ツールバーの範囲選択アイコンをクリックします。対象のピークを選択します。選択した範囲でマウスを右クリックし、ポップアップメニューで抽出 MS スペクトルをクリックして、結果を MS スペクトル結果ウィンドウに表示します。
このインビトロシステムをフラバノロンからフラボノールへの変換に使用できるかどうかを判断するために、NRNをシステムに追加した。ポリアミドTLCプレートには2つの新しいスポットが出現しました。あるスポットはDHKと同様の移動距離を示し、他のスポットはKMFと同様の移動距離を示した。
HPLCとLC-MSによるさらなる分析は、新しい化学物質がDHKおよびKMFのものと同一であった287および285のZ上の準分子イオンピークMで、それぞれ12分と20分の保持時間を示したことを示した。他のフラバノンを対応するフラバノールに変換するためにシステムを使用できるかどうかを判断するために、ERDをシステムに追加した。ポリアミドTLCプレート上の2つの新しいスポットは、それぞれDHQとQRCのそれと同様の移動距離を示した。
HPLCおよびLC-MS分析は、これらの新しい化学物質がそれぞれ10分と16分の保持時間を明らかにし、303と301のZ上の準分子イオンピークMがDHQおよびQRCのものと正確に一致することを実証した。合成系を調製する際には、最後に酵素を添加し、硫酸第二の鉄を最後に加える必要があります。はい、それは他の二次代謝産物の経済的生産のためのガイドを提供します。
