生体内伝播および培養VX2細胞から作られた後腹部リンパ管リンパデノパシーを有するオルトトピック子宮内膜癌モデル

このVX2子宮内膜癌モデルは、後腹膜リンパ節転移を有する画像誘導手術の技術を研究するために使用することができる。この技術の主な利点は、信頼性が高く、単純であり、ヒト子宮内膜癌のパターンを模倣する一貫した転移性広がりを生み出す点である。全体的に、これは簡単なテクニックです。

ただし、モデルを作成する前に縫合を練習することは、プロセスを容易にするのに役立ちます。この技術の視覚的なデモンストレーションは、モデルの確立に関与する外科的ステップを実証するのに役立つため、重要である。ハーレーチャンと私との手順を実証し、私はリリディン、私たちの研究室からの技術者になります。

インビトロ伝播されたVX2細胞を注射用に調製するには、37°CのビーズまたはウォーターバスでVX2細胞の凍結バイアルを1分間温めることから始めます。細胞が解凍されたら、10ミリリットルの培養培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を引き込む。遠心分離により細胞を沈下する。

ペレットを9ミリリットルの培地で再懸濁します。細胞を大きな培養フラスコに移して揺れることなく摂氏37度でインキュベーションを行い、光顕微鏡による合流を毎日チェックします。細胞が80%の合流度に達したら、フラスコに0.2%トリプシンの3ミリリットルを加え、細胞を5分間培養インキュベーターに戻します。

細胞が剥離したら、細胞懸濁液を円錐管に移し、遠心分離によって細胞を採取する。細胞ペレットを洗浄ごとに9ミリリットルの新鮮なPBSで3回洗浄します。最後の洗浄の後、氷上の新しい円錐管内のPBS濃度の1ミリリットル当たり4倍の10〜7個のVX2細胞に希釈する前に、数えるために新鮮なPBSの細胞を再中断します。

インビボ伝播VX2細胞で注射を準備するために、凍結した1センチメートルのVX2腫瘍ブロックを解凍し、メスを使用して培養プレート内の組織サンプルをミンチする。組織断片を70マイクロメートルのフィルターに移し、ハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)の1ミリリットルまでの小さなアリコートを加えて、すべての細胞がストレーナーを通過するようにします。次に、細胞懸濁液を氷上の無菌チューブ内のHBSS濃度の1ミリリットル当たり10倍に10倍に希釈する前に細胞を数える。

刺激に対する応答の欠如を確認した後、麻酔をした雌の白いニュージーランドのウサギを手術台の後ろ位置に置きます。骨盤と腹部の上に髪をクリップし、露出した皮膚をきれいにするために3段階の外科的皮膚の準備を使用する。外科用キャップとフェイスマスクを着用し、滅菌ガウンと無菌外科用手袋を着用する前に消毒剤で手をこすります。

恥骨の上部をランドマークし、下腹部の5センチメートルの領域を露出残して、腹腔切除ドレープで外科フィールドをドレープ。次に、数11のメスブレードを使用して、皮膚および皮下組織を介して、恥骨に2.5センチメートルの切開1センチメートルの頭蓋を作る。直腸筋膜を切開し、直腸筋を横に解剖して、基礎となる腹膜を露出させる。

下面が腸または他の腹部器官から離れであることを確認します。腹腔に入って膀胱を識別し、手袋をした指を優れた、後に、そして膀胱の頂点の上に横に掃いて子宮の角を見つける。腹部の切開を通して子宮の角を抽出し、腹壁に置きます。

3-0の編み込み吸収性縫合糸を使用して、各子宮ホーンの単一の縫合線結紮を行い、子宮頸部に約1.5〜2センチメートル遠位、子宮動脈を単に内側に入れる。その後、遠位子宮の角を含むように縫合糸をぴったりと結びます。以前に調製したVX2細胞懸濁液でミオメトリウムを接種するには、1ミリリットルの細胞を有する27ゲージ針を装備した1ミリリットルの注射器をロードする。

縫合糸と子宮頸部の間の縫合部位に、各子宮ホーン近位に1分間にわたって0.5ミリリットルの細胞懸濁液をゆっくりと注入する。その後、細胞漏れを最小限に抑えるために30秒間、心筋注射部位に圧力をかける。子宮の角を腹部に戻す前に、注射部位と縫合部位の止まり地を検査します。

深い腹壁閉鎖のために、腹膜切開の頂点を特定し、腹膜直筋および筋膜をつかむための外科クランプを使用する。3-0吸収性ポリフィラメント縫合糸を配置して縫合糸を固定し、切開部の一方の頂点を深く深くする表面的に、他方では表面的に深く配置する。付属の縫合糸を使用して、腹壁の層を通して切開に垂直なランニングステッチを作り、縫合糸を結び落として緩い端を切断する前に、左右の切開に沿って段階的に働きます。

表面的な腹壁閉鎖の場合、埋もれた下切除下3-0吸収性ポリフィラメント縫合糸を使用して、切開の片側を表面的に深く縫合し、表面的に他方の深部に縫合する。縫合糸を結んだ後、アンカーされた縫合糸を使用して、切開に平行な真皮層のランニングステッチを作り、切開に沿って段階的に作業します。縫合糸を結び、緩い端を取り除きます。

皮膚の縁をアポスするために閉じた切開に外科用接着剤を適用します。その後、動物が警戒し、独立して座ることができるまで、酸素と監視と暖かい毛布の上に動物を置きます。このモデルを確立する際、子宮角当たり7個の細胞に対して2回10回の投与量が4匹のウサギで成功し、接種から実験までの平均45日間で、培養されたVX2モデルに最適な注射用量として決定された。

インビボ伝播VX2モデルについては、接種から29日の実験までの平均時間で16匹のウサギで正常に作成され、子宮角当たり6個の細胞に対して5回10回、最適な注射用量として決定した。すべてのモデルは、後腹膜リンパ節の転移変換に成功した。さらに、培養されたVX2細胞からの腫瘍および転移性リンパ節は、組織学的解析によって生体内伝播VX2細胞の腫瘍に似ているように見え、デンシメトキソリン染色細胞は、侵入筋肉で観察され、多くの病理学的マイトの数字を有する腺のような構造を形成した。

縫合心を子宮動脈に置いて、血管穿刺からの出血を避け、子宮内膜腔ではなく細胞を子宮内膜に浸透するように注意してください。術後の感染を防ぎ、手術中にバリウム材料で身を守るために、モデル作成中に適切な滅菌技術を使用するように注意してください。