Este modelo de câncer endometrial VX2 com metástase de linfonodo retroperitoneal pode ser usado para estudar a tecnologia para cirurgia guiada por imagem. As principais vantagens dessa técnica são que ela é confiável, simples, e que cria uma propagação metastática consistente, que imita o padrão do câncer endometrial humano. No geral, esta é uma técnica simples.
No entanto, praticar a sutura antes de tentar criar o modelo ajudará a facilitar o processo. A demonstração visual dessa técnica é importante, pois ajuda a demonstrar os passos cirúrgicos envolvidos no estabelecimento do modelo. Demonstrando o procedimento com Harley Chan e eu seremos Lili Ding, uma técnica do nosso laboratório.
Para preparar células VX2 propagadas in vitro para injeção, comece aquecendo frascos congelados de células VX2 em uma conta de 37 graus Celsius ou banho de água por um minuto. Quando as células tiverem descongelado, puxe as suspensões celulares em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de cultura. Sedimentar as células por centrifugação.
Resuspend a pelota em nove mililitros de médio. Transfira as células para um frasco de grande cultura para incubação a 37 graus Celsius sem tremer, verificando as células diariamente para confluência por microscopia leve. Quando as células atingirem 80% de confluência, adicione três mililitros de 0,2% de trippsina ao frasco e devolva as células à incubadora de cultura celular por cinco minutos.
Quando as células se separarem, transfira a suspensão celular para um tubo cônico para coletar as células por centrifugação. Lave a pelota da célula três vezes com nove mililitros de PBS frescos por lavagem. Após a última lavagem, resuspenja as células em PBS fresco para contar antes de diluir para quatro vezes 10 para as sete células VX2 por mililitro de concentração de PBS em um novo tubo cônico no gelo.
Para preparar células VX2 propagadas in vivo para injeção, descongele um por blocos tumorais VX2 de um centímetro e use um bisturi para picar as amostras de tecido em uma placa de cultura. Transfira os fragmentos de tecido para um filtro de 70 micrômetros e adicione pequenas alíquotas de até um mililitro da solução de sal balanceada de Hank, ou HBSS, para garantir que todas as células sejam passadas através do coador. Em seguida, conte as células antes de diluir a suspensão celular para uma única vezes 10 às sete células VX2 por mililitro de concentração de HBSS em um tubo estéril no gelo.
Depois de confirmar a falta de resposta ao estímulo, coloque o coelho branco da Nova Zelândia anestesiado na posição dorsal na mesa de operação. Corte o cabelo sobre a pelve e abdômen, e use uma preparação cirúrgica de três passos para limpar a pele exposta. Usando um boné cirúrgico e máscara facial, esfregue as mãos com desinfetante antes de colocar um vestido estéril e luvas cirúrgicas estéreis.
Marco o topo do osso púbico e cubra o campo cirúrgico com cortinas de laparotomia, deixando uma área de cinco por cinco centímetros do abdômen inferior exposta. Em seguida, use uma lâmina de bisturi número 11 para fazer uma incisão de 2,5 centímetros um centímetro craniano para a púbica da sífilis através da pele e tecido subcutâneo. Incisar a fascia do reto e dissecar os músculos do reto lateralmente para expor o peritônio subjacente.
Confirme que a superfície inferior está livre do intestino ou outros órgãos abdominais. Entre fortemente no peritônio para identificar a bexiga urinária e varrer um dedo enluvado superior, posteriormente e lateralmente sobre o ápice da bexiga para localizar os chifres uterinos. Extrair os chifres uterinos através da incisão abdominal para descansar na parede abdominal.
Use uma sutura absorvível trançada 3-0 para realizar uma única ligadura sutura de cada chifre uterino, aproximadamente 1,5 a dois centímetros distal para as cervices e apenas medial para as artérias uterinas. Em seguida, amarre as suturas snugly para incluir os chifres uterinos distal. Para inocular o miométrio com a suspensão celular VX2 previamente preparada, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 com um mililitro de células.
Injete lentamente 0,5 mililitros da suspensão celular ao longo de um minuto em cada chifre uterino proximal ao local da sutura entre a sutura e o colo do útero. Em seguida, aplique pressão no local da injeção miometrial por 30 segundos para minimizar o vazamento celular. Inspecione os locais de injeção e sutura para hemostasia antes de colocar os chifres uterinos de volta no abdômen.
Para fechamento profundo da parede abdominal, identifique o ápice da incisão peritêneo e use um grampo cirúrgico para agarrar o músculo do reto peritônio e a fáscia. Ancore a sutura colocando uma sutura de polifilamento 3-0 absorvível, superficial a profunda em um ápice da incisão, e profundamente superficial na outra. Usando a sutura anexada, faça pontos de corrida perpendiculares à incisão através das camadas da parede abdominal, trabalhando passo-a-passo ao longo da incisão de um lado para o outro antes de amarrar a sutura e cortar as pontas soltas.
Para o fechamento superficial da parede abdominal, use uma sutura de polifilamento absorvível subcuticular enterrada 3-0 para sutura de sutura superficial de um lado da incisão e superficial para fundo do outro. Depois de amarrar as suturas, use as suturas ancoradas para fazer pontos de corrida na camada dérmica paralela à incisão, trabalhando passo-a-passo ao longo da incisão de um lado para o outro. Amarre as suturas e remova as pontas soltas.
Aplique cola cirúrgica na incisão fechada para apensar as bordas da pele. Em seguida, coloque o animal em um cobertor quente com oxigênio e monitoramento, até que o animal esteja alerta e capaz de sentar-se independentemente. Ao estabelecer este modelo, uma dose de duas vezes 10 para as sete células por chifre uterino foi bem sucedida em quatro coelhos, em um tempo médio de 45 dias de inoculação para experimento e foi assim determinada como a dose ideal de injeção para o modelo VX2 cultivado.
Para o modelo VX2 in vivo propagado, que foi criado com sucesso em 16 coelhos com um tempo médio de inoculação para experimento de 29 dias, cinco vezes 10 para as seis células por chifre uterino foi determinada como a dose ideal de injeção. Todos os modelos resultaram em uma transformação metastática bem sucedida dos linfonodos retroperitoneais. Além disso, tumores e linfonodos metastáticos de células VX2 cultivadas pareciam semelhantes aos tumores de células VX2 propagadas in vivo pela análise histológica, com células manchadas de densiostoxolina observadas no músculo invasor e formando estruturas glandulares como estruturas com muitas figuras micológicas patológicas.
Coloque sua sutura medial na artéria uterina para evitar sangramento de uma punção do vaso e tome cuidado para infiltrar as células no miométrio e não na cavidade endometrial. Tome cuidado para usar a técnica estéril adequada durante a criação do modelo para prevenir infecções pós-operatórias e para se proteger com o material de bário durante a cirurgia.
