このプロトコルは、銃声残渣の化学成分を検出するように設計されたユニークなバイオセンサーの調製および分析を記述する。法医学アプリケーションのためのバイオセンサーの使用はユニークです。これは、法医学研究所で一般的に使用される高度に特殊化された機器に代わる、低コストでシンプルに使用できます。
記載の合成生物学法は、標準的な合成生物学の部品を使用する任意のシステムに使用することができます。記載の化学分析は、赤色蛍光タンパク質を発現するあらゆるバイオセンサに適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ロングウッド大学の学部生であるアンドレア・ソールズとエル・リチャードソンです。
この手順を開始するには、マイクロ遠心チューブに、以前に単離されたJ10060プラスミドDNAの10マイクロリットルを加えます。8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。プロモーターDNAの場合、新鮮なマイクロ遠心分離チューブに10マイクロリットルのアニールプロモーターDNA配列を加えます。
8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。10マイクロリットルに設定されたピペットを使用して、サンプルを上下にそっとピペットして混ぜます。37°Cで30分間インキュベートします。
その後、酵素を80°Cで5分間加熱して活性させます。消化したDNAを冷凍庫に保管して、処理を進める準備が整います。まず、以前に消化されたプラスミドおよびプロモーターDNAを使用して、テキストプロトコルの表1に概説されているように、氷上のミクロセトリフュージチューブに反応を設定する。
最後にT4 DNAリガーゼを追加することを確認してください。ピペットを上下に軽く混ぜ合わせ、遠心分離機を短く混ぜます。室温で10分間インキュベートします。
その後、熱し、10分間摂氏65度で活性化します。テキスト プロトコルで説明されているように変換を実行します。まず、テキストプロトコルの表2に示すように、PCRの反応混合物を設定します。
ピペットを上下に軽くして反応を混ぜます。黄色のピペットチップを使用して、変換された大腸菌のコロニーを削ります。この大腸菌のスワイプを、切り離された新しいLBアンピシリン寒天プレートに移し、ピペットチップをPCRチューブに挿入します。
ピペットチップを振って、大腸菌とPCRミックスを混ぜます。追加のコロニーに対して、このプロセスをさらに3回繰り返します。次に、PCR チューブを PCR マシンにロードし、テキスト プロトコルの表 3 に示すようにサーモサイクリングを開始します。
テキストプロトコルの表4に概説されているように、適切な数の無菌培養チューブにラベルを付け始める。各チューブに調製した培養液の2ミリリットルを加えます。表 4 に示すように、チューブにアニライト ストック ソリューションを追加します。
次に、スナップキャップを培養管に置き、チューブに空気が流れるように緩みます。各培養管の渦。この後、チューブを摂氏37度、220 RPM以上で24時間揺れるインキュベーターに入れます。
まず、指の間を含む手のすべての表面を拭くためにリードを取り除くために設計されたエタノールベースのワイプを使用してください。分析まで適切にラベル付けされた密封可能なバギーにワイプを保管してください。アルコールベースのワイプを使用して、テストする大きな表面を拭き取ります。
エタノールで湿らせた綿のスワップを使用して、テストする小さな表面を拭き取ります。清潔な手袋を着用し、アルコール洗浄したはさみを使用して、ワイプの中心から約1平方センチメートルの部分を切ります。次に、切り取った部分のワイプ、または綿棒を、2ミリリットルのセンサー細菌を含む培養管に直接入れ、完全に水没していることを確認します。
500ナノメートルの励起波長で、RFPバリアントの適切な波長で蛍光の提出を収集するために分光計を準備します。次に、ボルテックスミキサーを使用してチューブを振ります。各上清を少量キュベットに慎重に移し、発光強度を収集します。
ボルテックスミキサーを使用して、チューブを振ります。200マイクロリットルのブロスをウェルプレートのウェルに移します。このプレートの各ウェルに入ったサンプルを記録します。
RFPバリアントに適した波長で発光強度を収集するために、小麦粉計を設定します。代表的なRFP変異体の蛍光スペクトルは、2つの異なるレベルのアニライトを加えた陰性対照とスペクトルの両方を示す。この研究で使用されるRFP変異体の最大蛍光シグナルは、575ナノメートルで観測される。
代表的なデータは、ポータブル分光計と蛍光計の両方から、同じソリューションのセットのために収集されます。アニライトの濃度が高くなるにつれて蛍光が増加する一般的な傾向がある。鉛センサーの10億分の800を超える高濃度では、このような高濃度での鉛の毒性のために応答が低下することは注目に値する。
使用済みの40口径カートリッジケースの内部からエタノール綿棒サンプルを分析すると、原理的な結果を証明します。3つのセンサー細菌のそれぞれから陽性の結果は、銃声残渣に対する陽性試験を示す。このプロトコルで調製されたバイオセンサーは、食品、水、または環境サンプルの汚染を検出するために個別に使用することもできます。
この技術は、研究者が様々な異なる化学アニライトのための標準的な合成生物学技術を使用してバイオセンサーを開発する道を開きます。個人的な保護具を着用する必要があり、アナリストは大腸菌を扱った後、手を洗い、表面を消毒する必要があります。廃棄物はオートクレーブ化し、重金属を含む廃棄物はこれに応じて処理する必要があります。
