哺乳類の発達における遷移金属の役割は、主に過小評価されている。新たな証拠は、金属恒常性が細胞および組織の発達段階に従って変化し続けていることを示す。さらに、金属の特定の細胞の目的地も開発中の品種であり、もちろん、その位置を特定することは困難です。
現在までに、金属を定量化するためにさまざまな分析技術が開発されてきましたが、ほとんどが高価またはアクセスできません。よりアクセスしやすく効率的な方法で金属の決定を改善するために集中的な研究が焦点を当てています。グラファイト炉原子吸光分光法GF-AASは、主に2つの利点を有する。
それは正確なトレース亜鉛分析を可能にする、亜鉛の検出の低い限界を提供する。また、大量のサンプルを必要としない技術であり、マイクロリットルの溶液は分析を行うのに十分である傾向がある。これら 2 つの利点を組み合わせると、低容量サンプルのトレースエレメントを解析するのに最適な GF-AAS が実現します。
いくつかの人間の病理学的状態は、金属のミスバランスに関連しています。いくつかの例は、貧血、湿疹性腸炎、およびウィルソンとメンケス病です。そのため、生体試料中の遷移金属のレベルを高感度かつ正確に測定する効率的で信頼性の高い方法を開発することが重要です。
GF-AASは、正常な生理学的条件および病原性の場合に、任意の特定の金属の決定を容易にする技術上の優れた例である。この方法は非常に汎用性があります。多くのシステムに適用でき、多くの要素はGF-AASを使用して分析することができます。
課題は、実際に検出方法の限界を確立し、サンプルがこの限界内に収まるようにすることです。サンプルの量が少ないということを考えると、テストの余地があまりないので、最初からデータを慎重に検討する必要があります。サンプルの最初の分析の後、我々は定量に必要な限界にサンプルをもたらすために必要な希釈係数が何であるかを確立する必要があります。
AASに行く前に、核を適切に分画できることを確認してください。ウエスタンブロットは分光分析の前に常に良好な検証です。GF-AAS は少量を必要としますが、細胞内プールはすでに少量です。
それはテストのためのほとんど余地を与える。最初の測定は慎重に行い、調べる必要があるので、サンプル処理は1つの希釈因子に最小限に抑えることができます。まず、55平方センチメートルのプレートに関心のある細胞を培養します。
真空トラップを使用して培養メディアを吸引します。メディアのトレースをすべて削除してください。カルシウムとマグネシウムを含まない氷冷PBSを使用して、所望の時点から細胞をリンスするか、または培養条件で3回洗浄します。
その後、プレートに氷冷PBSの1ミリリットルを追加し、プレートから細胞をこすり落とします。細胞懸濁液を1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、氷の上に置きます。遠心分離機をGの10,000倍で10秒間、吸引により上清を除去した。
細胞質および核分の金属分析が望ましい場合、非イオン性洗剤である0.1%NP-40を含む氷冷PBSの400マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。100マイクロリットルを新しいマイクロ遠心チューブに全細胞サンプルとして移し、マイナス20度で保存します。核を分離するには、P1000マイクロピペットチップを使用して、400マイクロリットルセルサスペンションを氷上で5〜10回上下にピペットします。
次いで、5マイクロリットルの細胞懸濁液を抽出し、それを顕微鏡ガラススライドに移します。5マイクロリットルを光顕微鏡の下に置き、40倍の目的を使用して核の完全性を検証します。遠心分離395マイクロリットル細胞のライセート懸濁液を10,000倍のG.新しいマイクロ遠心チューブに細胞質画分を含む上清を移す。
次に、0.1%NP-40を含むPBSの500マイクロリットルを加えて、ペレットを核画分ですすい、遠心分離機を10,000倍G.上清を除去し、同じ溶液の100マイクロリットルで核を含むペレットを再懸濁する。細胞を溶解するには、Bioruptorを使用して、溶液全体と核含有溶液を3回、それぞれ5分間超音波処理します。核または細胞質分画のいずれかに特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロットによる画分の純度の品質管理を行う。
まず、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに100、500、100マイクロリットルの細胞懸濁液を含む細胞質および核分率を全細胞に、微量金属グレードの濃縮硝酸の等量を加え、80°Cの熱ブロックに入れて1時間分の細胞培養液を鉱化する。その後、熱ブロックからチューブを取り出し、ラックに入れて摂氏20度で一晩酸消化を継続します。過酸化水素のサンプル容量の30%を加えて反応を停止する。
18メガオーム精製水でサンプルの体積を500マイクロリットルに持って来ます。次に、15ミリリットルファルコンチューブで18メガオームで精製水中の分析グレード標準一酸化窒素を希釈し、較正中に2体積%の硝酸溶液をブランク溶液として調製した。次に、2体積パーセントの硝酸溶液を使用して、10億分の1,000部の濃度で市販の1,000ppm亜鉛ストック溶液を希釈します。
100万個の亜鉛標準液あたり1,000個、10億個/100個の溶液から作業標準溶液を準備し、5、8、10、15、20、25 ppbに直接希釈し、2体積硝酸溶液で直接希釈します。0.1%硝酸マグネシウムマトリックス調整剤の1ミリリットルをポリプロピレンサンプルカップに入れ、カップをオートサンプラーカルーセルに積み込みます。原子吸光分光計をプログラムし、5マイクロリットルのマトリックス調整剤を亜鉛規格とブランクに自動的に加えます。
標準溶液とサンプルの原子吸光分光計に同じ最適化条件を設定し、導入流量は毎分250ミリリットル、射出温度は摂氏20度、グラファイト炉温度は4段階のプロセスで摂氏1,800度に達します。キャリブレーションの違いや蒸発によるミスを避けるために、1つの実験のすべての標準とサンプルを同時に測定する必要があります。ランプC-HCLを20アンペアの電流、213.9ナノメートルの波長、0.7ナノメートルのスリットに最適化します。
ポリプロピレンサンプルカップにサンプルをピペットし、オートサンプラーカルーセルに入れます。亜鉛の検出の下限は10億分の0.01です。規格の濃度を上げることで、亜鉛の検出の上限は10億分の20と判定されます。
亜鉛標準曲線が得られた後、金属含有量を測定するために、鉱物化されたサンプルを測定します。得られたデータが検出限界を超えている場合は、0.1%分析グレードの硝酸で処理された18メガオーム精製水でサンプルを希釈します。核プロトコルのこの急速な単離では、一次筋芽細胞との区別から代表的なウェスタンブロットは、細胞内分画の純度を示す。
クロマチンリモデラー酵素Brg1を使用して、核画分を同定し、チューブリンを使用して、細胞系分画を同定した。この図は、各細胞型の増殖および分化またはコンフルエントモノレイヤー、および全細胞抽出物、細胞構造および核画分における対応する亜鉛含有量を示す代表的な光顕微鏡写真を示す。この研究で分析されたすべての細胞株は、ナノモル範囲の亜鉛濃度を示した。
分化された一次筋管は増殖細胞よりも高いレベルの亜鉛を示した。同様の細胞下の亜鉛分布が、神経芽細胞株N2Aで検出された。一方、確立された3T3-L1細胞株は、前のアディサイトが誘導または分化されたときよりも増殖した場合、より高いレベルの亜鉛を示した。
MCF10A細胞は、増殖細胞における細胞分裂と核分画の間で亜鉛の等しいレベルを示した。MCF10A細胞が合流に達すると、全細胞亜鉛レベルの40%の減少が検出され、金属は細胞体分画中に最も濃縮されることがわかった。グラファイト炉原子吸光分析は、生体および環境試料中の遷移や重金属を測定する高感度技術です。
最小限の汚染が装置の感度のために分析を妨げる可能性が高いため、細胞内分画の調製における特別な注意と清潔さを考慮する必要があります。すべての実験で金属の体積と微量レベルが低いことを考えると、GF-AASよりも亜鉛を測定するためのより良い、より正確な技術を考えるのは困難です。GF-AAS の比較的低コストで必要な検出と少量の制限を提供できる最新の手法はありません。
グラファイト炉原子吸光分析は、正確で、敏感で、費用対効果が高く、アクセス可能です。この分析技術は、元素検出技術の進歩に伴い、改善し続けます。GF-AASによる亜鉛やその他の金属の検出に関する今後の応用には、臓器、動物モデルから得られた組織、全身金属不均衡に関連する疾患患者からの生検が含まれる。
硝酸は、非常に迅速に重度の化学熱傷を引き起こすことができる非常に腐食性の酸です。この化学物質はまた、金属粉末などの特定の化合物と激しく反応することができます。硝酸による危険があるため、硝酸を取り扱う際には厳重な安全対策を講じる必要があります。
硝酸を取り扱う際には、安全化学眼鏡、スプラッシュ保護用のフェイスシールド、手袋、換気が不十分な場合は承認された蒸気呼吸を着用することを強くお勧めします。
