C.elegans胚発生には約13時間かかり、通常は一度に1つの胚を撮影することによって監視されます。しかし、私たちのプロトコルは、80〜100胚の同時3Dタイムラプスイメージングを可能にします。開発中の大量のC.elegans胚のデータを収集する能力は、発達事象や大規模なスクリーンの定量分析を含む新しい範囲の実験を開きます。
このプロトコルは、異なる発達過程を捕捉したり、目的の組織でマーカーの任意の組み合わせを発現する胚を画像化するために容易に適応することができる。井戸内の胚を適切に分散させるのは難しいです。これらは、異なるZ平面に集まりることなく、フィールドごとに複数の胚を捕獲できるように、密接にする必要があります。
私たちは、サイドバイサイド解剖、氷上、未使用の井戸を遮断するために2人の研究者を使用することをお勧めします。また、よく上演された384ウェルプレートを素早く設定するための便利なトリックも紹介します。まず、未使用のウェルをマスクするために、ガラス底の384ウェルプレートにPCR接着剤ホイルを密封します。
使用するために井戸のサブセットを公開するために箔を切り取るためにカミソリやメスを使用してください。準備したてのTMHCを70マイクロリットルずつ各井戸に加え、プレートを氷の上に置きます。エッジ効果を防ぐために、プレートの外側の 2 つの行を除外します。
迅速なサンプル調製には、2人の研究者による横並び解剖が推奨される。すべての溶液がメッキされたら、細かいピンセットと解剖顕微鏡を使用して、約10人のグラビッド成人を1つのうつ病スライド内の氷冷TMHC溶液の150マイクロリットルに移します。ピンセットとメスを使用して、ワームを解剖して胚を放出し、引っ張られた毛細管ピペットを口の吸引器にロードする。
口のピペットを使用して、2〜8細胞のステージ胚のすべてを調製されたプレートの個々の井戸に移し、プレートを調べて、どの井戸内にも凝集物がないことを確認します。すべての胚が採取されたら、遠心分離によって標本を沈降させ、エタノール浸しのワイプを使用してプレートの底から残留物を取り除きます。温度制御された環境を備えた共焦点顕微鏡のプレートホルダーにプレートを置き、10Xの目的を使用して各ウェルの事前スキャンを行い、適切な胚を持つフィールドを識別します。
スキャンの最後に、60Xの目的に切り替え、各ポイントの焦点面を調整してウェルあたり1〜4つのフィールドを画像化し、10時間20分間隔で2マイクロメートル間隔で18 Zセクションを取得します。すべての画像が取得されると、胚致死性を評価するために、一晩のイメージング開始後約20〜24時間、低い、全く明視野スキャンを行う。胚クロプUI実行可能ファイルを使用して自動トリミングの場合は、まずZenodoとテストファイルからプログラムをダウンロードしてください。
zip を使用して、プログラムがプラットフォーム上で正しく機能しているかどうかを確認します。ダウンロードしたら、解凍して移動して、胚クロップUI実行可能ファイルを見つけ、ダブルクリックしてプログラムを起動します。[開く]を選択すると、最初に特定の 4D 視野がトリミングされます。
複数の寸法を持つ TIFF シリーズをトリミングすると、フォルダ内のシリーズの最初のイメージのみが読み込まれます。すべての画像がロードされたら、イメージングパラメータを指定し、背景減算と減衰補正を選択し、画像収集順序とピクセルあたりのミクロンを設定します。次に、[実行] を選択すると、トリミングされていないフォルダと同じパスに新しいサブフォルダが作成され、トリミングされたバージョンがこの場所に保存されます。
可視化のために、オープンと組み合わされたMSV2 ImageJプラグインとグラフィックユーザーインターフェースの指示Zenodorepov2をダウンロードしてください。ゼノドからdocxとIMageJでプラグインを開きます。3 行目と 4 行目を見つけ、トリミング後にイメージ フォルダが保存される場所を入力します。
処理する条件のイメージ フォルダー名、および一晩の実験ごとに一意の英数字の識別子。すべての情報が入力されたら、[実行] をクリックします。ウィンドウが表示され、トリミングされたイメージ フォルダを含む外側のフォルダに移動するプロンプトが表示されます。
選択すると、イメージングパラメータの指定が可能な別のウィンドウが表示されます。[大丈夫]をクリックします。複合ファイルのアセンブルが開始されます。
コンポジットが生成されたら、開いたままのファイルを確認します。カスタムレポーター株を組み合わせて画像化すると、ほとんどの主要な開発イベントに有益な読み出しを提供します。硫酸塩の指定、背間カレーション、表皮の囲い、伸び、および神経新生を含む。
射出後24時間はイメージングに最適なタイムポイントです。この時点で、母親のタンパク質の枯渇と接合性遺伝子発現の阻害は、硫酸塩の指定および形態形成に関与する幅広い遺伝子に対して、明確で再現性の高いシグネチャー表現型を生み出す効果が高い。解剖および胚選択のステップの間に忍耐強くすることが重要である。
凝集を最小限に抑え、適切な焦点平面を選択することも、高品質のデータを確保するために不可欠です。当社のプロトコルは、さまざまな蛍光マーカー株とRNAiまたは変異体と組み合わせて実行できます。当社の処理ツールにより、合理化された、自動化された、または手動のデータ分析が可能になります。
ここで説明した菌株、方法、ツールを用いて、胚発生に必要な約2,000個の遺伝子を対象としたRNAiベースの高含有スクリーンを実施しました。このプロジェクトでは、半高スループット方式が不可欠でした。
